【摘 要】
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发酵食品是微生物发酵而成的一种口味独特、营养价值高的食品,是食品产业的重要组成。有效的微生物分离、分析方法对于保证发酵食品的质量稳定和安全尤为重要。针对现有的微
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发酵食品是微生物发酵而成的一种口味独特、营养价值高的食品,是食品产业的重要组成。有效的微生物分离、分析方法对于保证发酵食品的质量稳定和安全尤为重要。针对现有的微生物分离、分析方法存在的检测灵敏度和准确性受限、微生物样品无法回收、检测样品制备方法复杂等问题,本课题将高效液相色谱技术(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)创新性地应用在微生物的分离、分析中。课题以发酵红曲为试样,通过红曲细菌样品制备条件优化、HPLC条件优化、菌体细胞回收、变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)分析以及菌种鉴定等实验,探讨了 HPLC在发酵食品微生物分离、分析中的应用潜力。论文主要研究内容和结果如下:1.红曲细菌HPLC样品制备条件的优化。根据物质之间可能存在的静电引力、疏水相互作用以及氢键,对样品处理条件进行优化。结果表明:HPLC样品制备最佳处理液为:0.02 M、pH 8.0的哌嗪-HC1缓冲液(含0.2M NaCl),涉及到的制备步骤包括搅拌、过滤、离心和抽滤。2.红曲细菌HPLC条件的确定。采用TSKgel Toyopearl SuperQ-650C强阴离子交换树脂,在260nm紫外检测波长下,对缓冲液pH、最大洗脱盐浓度、样品浓度和上样量等条件进行优化。确定最佳色谱条件为:样品浓度为40X浓缩(相当于红曲处理量40.0g/mL)、最适缓冲液pH 8.0、最大洗脱NaCl浓度1.OM、最适上样量为500μL浓缩样品。3.红曲细菌的高效液相色谱表征。在优化的色谱条件下,表征四种梯度洗脱条件下样品的色谱行为。实验共收集到20个洗脱峰,结合显微镜观察,其中19个是细菌峰。4.细菌峰的PCR-DGGE分析。采用PCR-DGGE方法初步判断19个细菌峰中纯菌峰的可能个数。经V3可变区DGGE分析,其中有9个细菌峰DGGE图谱为单一条带,根据DGGE实验原理,该9个峰初步判定为纯菌峰;5.细菌峰样品的测序以及菌种鉴定。将9个可能的纯菌峰对应的16SrDNA序列进行测序,结合NCBIBLAST和进化树的构建对测序结果进行分析。结果发现,红曲细菌样品色谱分离得到的9个峰均成功测序,鉴定结果包括环状芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、人参土芽孢杆菌和脂肪酸芽孢杆菌。以上研究表明,HPLC能实现红曲细菌的纯种分离和快速分析,并具有准确、样品可回收等优点,能为发酵食品微生物的分离、分析提供新的思路。
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