论文部分内容阅读
抗菌肽是一类具有抗菌作用的免疫活性物质，是动物非特异性免疫系统的重要组成部分。他们对细菌，真菌，病原虫以及癌细胞均表现出抗菌活性。近年来传统抗微生物制剂的毒副作用及其耐药菌株的出现，迫使人们去寻找新型的抗微生物制剂。Metchnikowin 基因编码的抗菌肽具有抗革兰氏阳性菌和真菌性能。然而由于与传统抗微生物制剂抗菌机理不同，该抗菌肽不会产生抗药菌株，有潜力成为新品种的抗微生物制剂，具有广阔的应用前景。
本实验旨在通过基因工程的手段构建出能够稳定表达Metchnikowin基因的毕赤酵母真核表达系统，大量获得具有生物学活性的表达产物，并进一步检测利用真核系统中表达获得该多肽的抗菌性，稳定性，期望能为该抗菌肽在抗微生物制剂领域应用提供理论依据。
本研究根据GeneBank中提交的序列，以果蝇总DNA模板，利用PCR技术，扩增出两端加入了连接接头的 Metchnikowin 基因，将接头处理成粘性末端，以便与经过CpoI及Not I酶切后的pHBM 905B表达载体正确连接。将Metchnikowin基因与分泌型酵母表达载体pHBM 905B连接，构建成重组酵母表达载体pHBM 905B/Metchnikowin，经“三明治”夹心平板筛选及菌落PCR鉴定证明目的基因已整合入酵母染色体中。挑选阳性克隆菌株与100ml摇瓶中在甲醇诱导下大量表达，观察表达量变化，以SDS-PAGE分析表达产物，用琼脂扩散法检测表达多肽的生物学活性，以及测试该表达多肽的热稳定性和PH值耐受性。实验结果表明该表达多肽相对分子量约为6.5KD，证明与糖基化后预期分子量大小一致。用琼脂糖扩散法检测上清液的生物学活性，观察到明显的抑菌圈，显示其具有较强的抗革兰氏阳性菌和真菌活性，并且表达产物有极强的热稳定性，同时在不同PH值环境下仍能发挥抗菌活性。结果表明该种抗菌肽能很好的在毕赤酵母表达系统中得到表达，并且在进一步的抗菌活性和稳定性研究中发现该抗菌肽具有较强的抗菌活性，良好的热稳定性以及广泛的PH值耐受性，这些特性使该抗菌肽具有非常诱人的应用前景，并且为以后进一步的药学分析研究及工业批量生产奠定了基础。