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背景NG2细胞属于胶质前体细胞,广泛存在于哺乳动物中枢神经系统中,在中枢神经损伤后广泛增生并参与胶质瘢痕的形成。它具有多种分化潜力,有证据显示,NG2细胞能够在体外环境中分化成神经元。这表明NG2细胞可以作为一种种子细胞,应用于神经退行性疾病的治疗。血小板反应蛋白4(Thrombospondin-4,THBS4)是血小板反应蛋白家族的成员之一,是细胞外基质分泌的一种蛋白。THBS4在调控神经系统发育和信号转导过程中扮演着十分重要的角色,但THBS4在NG2细胞分化中的作用和机制尚不清楚。本课题拟利用基因沉默和基因过表达技术,研究THBS4基因对NG2细胞体外分化的影响,揭示THBS4在NG2细胞命运重编程过程中的作用,为神经退行性疾病提供新的细胞治疗方案。目的1.探究THBS4在调控NG2细胞重编程中的作用;2.分析THBS4影响那些转录因子调控NG2细胞的重编程过程。方法1.THBS4对NG2细胞向神经元方向分化的影响使用THBS4的过表达病毒质粒感染永生化的NG2细胞,利用蛋白质免疫印迹以及实时定量荧光PCR等技术检测神经元标志物的表达水平;使用小干扰RNA沉默NG2细胞中的TNBS4,利用蛋白质免疫印迹以及实时定量荧光PCR等技术检测神经元标志物的表达水平;2.THBS4对NG2细胞向胶质细胞方向分化的影响使用THBS4的过表达病毒感染NG2细胞,利用蛋白质免疫印迹以及实时定量荧光PCR等技术分析少突胶质细胞和星形胶质细胞标志物的表达情况;使用小干扰RNA沉默NG2细胞中的THBS4,利用蛋白质免疫印迹以及实时定量荧光PCR等技术分析少突胶质细胞和星形胶质细胞标志物的表达情况;3.THBS4对重编程相关转录因子表达的影响使用THBS4的过表达病毒感染NG2细胞,利用实时定量荧光PCR检测转录因子Ngn1、ATF6、Olig2的变化;使用小干扰RNA沉默NG2细胞中的THBS4,利用实时定量荧光PCR检测转录因子Ngn1、ATF6、Olig2的变化;结果1.为了验证THBS4对NG2细胞向神经元重编程的影响,在NG2细胞中进行THBS4的过表达,结果发现在神经元标记物Tuj1、MAP2的表达水平随着THBS4表达水平的增高而增高。沉默THBS4的表达,Tuj1、MAP2的表达趋势刚好相反;这说明THBS4可以使NG2细胞向神经元重编程。2.为了验证THBS4对NG2细胞向胶质细胞重编程的影响,在NG2细胞中进行THBS4的过表达,结果发现少突胶质细胞的标记物和星形胶质细胞的标记物表达量随着THBS4表达水平的增高而降低。沉默THBS4的表达,胶质细胞标记物的表达趋势与之相反。这说明THBS4可以抑制NG2细胞向胶质细胞重编程。3.为了验证哪个重编程相关转录因子在NG2细胞重编程过程中起作用,在NG2细胞中将THBS4过表达,结果发现转录因子Ngn1的表达量随之升高。沉默THBS4的表达,得到了相反的结果。这说明THBS4通过激活转录因子Ngn1在NG2细胞向神经元重编程过程中发挥作用。结论1.THBS4促进NG2细胞向神经元重编程。2.THBS4抑制NG2细胞向胶质细胞重编程。3.THBS4通过上调转录因子Ngn1参与这个过程。