论文部分内容阅读
文昌鱼是现存的与脊椎动物原始祖先最接近的无脊椎动物，长期以来一直作为研究动物进化和胚胎发育的典型材料。目前，文昌鱼的基因序列和表达模式己被广泛应用于不同物种之间的比较基因组学研究和发育同源性分析。本论文首次利用PCR和RACE技术克隆到青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)卵巢中的一种编码丝氨酸蛋白酶ovochymase的cDNA，将其命名为BbOvc，并对其结构、表达和功能进行了初步研究。
BbOvc的cDNA全长1，792 bp，其中5’非翻译区(5’UTR)由123 bp组成：3’非翻译区(3’UTR)由421 bp组成；含有一个1，248 bp的开放阅读框(ORF)，编码一个由415个氨基酸组成的蛋白质，该编码的蛋白分子量推断为44.4 kDa，等电点为5.54。BbOvc在174～408氨基酸残基之间形成一个完整的Tryp_SPc，包含由His222，Asp267和Ser363三个氨基酸残基组成的催化三联体结构，以Ser363为活性中心，属于典型的S1家族丝氨酸蛋白酶。口袋底部的氨基酸残基(与Ser363相隔5个氨基酸)为Asp，属于类胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶。
Ovochymase目前只在人、爪蟾、小鼠、犬属、牛和斑马鱼等脊椎动物中发现，且主要有ovochymase1和ovochymase2两个家族，虽然它们之间的序列差别很大，蛋白长度相差也很大，但都包含CUB和Tryp_SPc两个结构域，而我们得到的基因中也包含这两个保守结构域，所以可初步确定为文昌鱼中的ovochymase。进一步通过CLUSTALW方法比较BbOvc和其他已知物种的丝氨酸蛋白酶，发现此蛋白和爪蟾的ovochymase、人的ovochymasel分别有30.8％和30.6％的同源性，且与他们聚为一类。
我们研究了ovochymase的mRNA在文昌鱼中的表达情况。Northern和原位杂交分析表明，BbOvc在成体组织的卵巢中特异表达，且为单拷贝，大小约为1，800bp，与我们克隆获得的cDNA大小基本一致。在胚胎发育的单细胞、四细胞和十六细胞时期的信号较强，随后逐渐减弱，晚期原肠胚和神经胚杂交信号基本消失。
我们又对BbOvc的功能进行了初步分析。通过构建原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，发现BbOvc在包涵体中大量表达；纯化出重组蛋白BbOvc后，通过免疫动物制备了多克隆抗体，在性成熟的文昌鱼卵巢提取液中检测到了ovochymase的存在，大小为45 kDa左右；对重组蛋白经透析复性后，发现该蛋白具有类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶活性，可专一性地水解胰蛋白酶的特异性底物BAEE，即水解精氨酸羧基形成的酯键，而不能水解胰凝乳蛋白酶的底物BTEE，且其活性可被大豆胰蛋白酶抑制剂所抑制。另外研究发现，该重组蛋白可抑制革兰氏阴性菌大肠杆菌的生长，具有一定的抑菌的活性，但不能抑制革兰氏阳性菌葡萄球菌的生长。由此看出BbOvc是一种具有抑菌活性的新型ovochymase丝氨酸蛋白酶，是保护早期胚胎免受外源病原体入侵的相关免疫分子。