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一、目的观察阿曼托双黄酮(Amentoflavone,AF)对匹罗卡品致痫大鼠学习记忆功能的影响,探究其作用机制;研究阿曼托双黄酮对大鼠岛叶神经元癫痫样放电的影响和对GABAR通道电流的调节作用。二、方法1.阿曼托双黄酮对癫痫大鼠记忆损害的改善作用清洁级健康雄性SD大鼠36只,体质量220~250g,随机分为双黄酮干预组、癫痫组、空白对照组,每组12只。双黄酮干预组每日定时腹腔注射AF(25mg/kg),另两组以等量生理盐水腹腔注射,连续5d。第5天腹腔注射氯化锂(127mg/kg),18h后双黄酮干预组和癫痫组腹腔注射匹罗卡品(30mg/kg)。癫痫发作行为依据Racine分级标准分为6级,大鼠出现连续3次Ⅳ级、Ⅴ级惊厥被认为点燃成功。用Morris水迷宫测验大鼠学习记忆,通过找出水迷宫中隐藏平台的逃逸潜伏时间和通过原平台所在位置的次数,评估大鼠学习记忆功能情况,观察药物干预对癫痫大鼠记忆损害的改善作用。2.阿曼托双黄酮对海马组织内氧化应激及胆碱能功能的影响水迷宫行为学实验结束后对各组大鼠行断头取脑,用免疫组织化学染色检测海马组织乙酰胆碱含量,酶联免疫吸附测定乙酰胆碱酯酶活性,用硫代巴比妥酸法测定MDA,用二硫代二硝基苯甲酸法测定GSH。观察比较阿曼托双黄酮干预对癫痫大鼠氧化应激和胆碱能功能的影响,探究其改善记忆损伤的机制。3.阿曼托双黄酮对4-氨基吡啶诱导的大鼠岛叶神经元癫痫样放电的影响选择出生4-5周大的SD大鼠,麻醉后快速断头取脑,制备400um厚的岛叶脑片,以37℃的人工脑脊液孵育1小时,待神经元稳定后以用4-氨基吡啶外液持续灌流30-40min,诱发岛叶神经元癫痫样放电。用全细胞膜片钳电流钳记录模式,记录4-氨基吡啶诱导的癫痫样放电活动,再以不同剂量的阿曼托双黄酮进行干预,观察比较阿曼托双黄酮干预后神经元放电频率和放电持续时间的变化,评价阿曼托双黄酮对神经元癫痫样放电的影响。4.阿曼托双黄酮对GABAR通道电流的调节作用制备脑片,选取形态良好的岛叶神经元,随机分成Control组、GABA组和AF干预组。用全细胞膜片钳电压钳记录模式,以离子通道阻滞剂外液阻断神经元基本电活动后用GABA外液诱发神经元GABAR电流,再用不同浓度的阿曼托双黄酮干预,比较干预后GABAR电流的变化,评价阿曼托双黄酮对GABAR电流的调节作用。5.统计分析采用SPSS21.0统计软件对数据进行分析,实验结果以X±S表示,组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。三、结果1.Morris水迷宫实验找出水迷宫中隐藏平台的逃逸潜伏时间越短和通过原平台所在位置的次数越多,分别表示大鼠的空间学习能力和空间记忆能力越强,反之亦然。对比各组逃逸潜伏期,癫痫组较空白对照组显著延长(P<0.01);双黄酮干预组比癫痫组显著缩短(P<0.01);通过原平台所在位置次数比较,癫痫组比空白对照组显著减少(P<0.01);双黄酮干预组比癫痫组显著增加(P<0.01)。2.海马Ach E阳性神经元表达免疫组织化学切片背景呈浅黄色,Ach E免疫反应阳性神经元呈不同程度的棕黄色。空白对照组、癫痫组、双黄酮干预组CA3区Ach E免疫反应阳性神经元数分别为40.6±10.2、7.1±2.2、32.8±8.4。癫痫组CA3区Ach E免疫反应阳性细胞数量比空白对照组明显减少,染色浅(P<0.01);双黄酮干预组CA3区Ach E免疫反应阳性细胞数量比癫痫组明显增加,染色深(P<0.01)。3.海马Ach E活性浓度空白对照组、癫痫组、双黄酮干预组Ach E活性浓度(U/L)分别为38.61±4.90、7.54±2.34、30.66±5.79。与空白对照组比,癫痫组海马Ach E活性显著降低(P<0.01);与癫痫组比,双黄酮干预组海马Ach E活性显著增加(P<0.01)。4.MDA和GSH含量空白对照组、癫痫组、双黄酮干预组MDA(nmol/mgprot)含量分别为4.10±0.42、9.50±1.11、5.25±0.98,GSH(mg/gprot)为5.20±0.53、2.81±0.31、6.08±0.54。相对于空白对照组,癫痫组大鼠MDA水平显著增加(P<0.01),GSH显著减少(P<0.01);相对于癫痫组,双黄酮干预组MDA水平显著减少(P<0.01),GSH显著增加(P<0.01)。5.阿曼托双黄酮对4-氨基吡啶诱导的大鼠岛叶神经元癫痫样放电的影响在全细胞电流钳记录模式下,Control组大鼠岛叶神经元呈现出单个偶发的去极化发放,这是大鼠岛叶区神经元的基本电生理活性,通过4-氨基吡啶外液持续灌流孵育大鼠岛叶脑片30-40min后,神经元逐渐出现稳定的促发性癫痫样放电。记录结果显示,经过5ug/ml、10ug/ml和20ug/ml不同浓度的阿曼托双黄酮干预后,岛叶区神经元促发性癫痫样发电的持续时间和癫痫样放电的发放间歇期没有明显的改变。用正常的人工脑脊液对岛叶脑片进行洗脱灌流,可见神经元的癫痫样放电次数逐渐减少,发放间歇期逐渐延长,并最终恢复到Control组的状态。统计结果显示,各浓度阿曼托双黄酮干预组均不能显著减少岛叶神经元癫痫样放电的持续时间和放电频率。6.阿曼托双黄酮对GABAR通道电流的调节作用用浓度为20ug/ml的阿曼托双黄酮外液对大鼠岛叶脑片进行灌流后,诱发出的GABAR通道电流与灌流GABA外液相比,其电流幅度没有发生明显的改变(图2.1 AF组),实验结果表明阿曼托双黄酮对GABAR电流不产生效应。四、结论1、阿曼托双黄酮可以改善致痫大鼠的学习记忆功能,通过提高海马乙酰胆碱酯酶的活性,抑制氧化应激反应。2、阿曼托双黄酮对岛叶神经元的癫痫样放电无明显抑制作用。3、阿曼托双黄酮对GABA诱发的岛叶神经元GABAR通道电流不产生调节效应。