【摘 要】
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目的:探讨PML核体调控纺锤体检查点的分子机制及对SUMO化修饰的调控机制。 方法:在MCF-7细胞中过表达myc-PML，通过免疫沉淀和SDS-PAGE方法分离获得Myc-PML融合蛋白，利用质谱
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目的:探讨PML核体调控纺锤体检查点的分子机制及对SUMO化修饰的调控机制。 方法:在MCF-7细胞中过表达myc-PML，通过免疫沉淀和SDS-PAGE方法分离获得Myc-PML融合蛋白，利用质谱和磷酸标记抗体检测PML p409磷酸化位点，从免疫兔血清中纯化出PML p409特异性抗体并通过免疫印迹检测。用含羞草素，胸腺嘧啶、诺克哒唑或紫杉醇、胸腺嘧啶双阻断释放的方法获得细胞周期不同时相的细胞，检测细胞周期中PML磷酸化动力学。采用共聚焦荧光实时摄像技术计算瞬时表达PML蛋白或SiRNA序列的H2B-GFP融合蛋白的HeLa细胞（或MCF-7细胞）中有丝分裂时间（从核膜崩解到后期发生）和观察有丝分裂期染色体形态及运动特性。检测过表达PML WT，T409A，T409D的MCF-7细胞中有丝分裂指数，并分析了有丝分裂中期染色体形态。检测纳克达唑处理释放不同时间点PML-WT，T409A，T409D突变体抑制细胞凋亡的能力。体外培养正常人的胚胎肺成纤维细胞(HEL)，永生化的细胞(HEK293)和肿瘤细胞株(MCF-7和HeLa)中稳定转染和瞬时表达PMLⅣ的野生型蛋白和T409A突变体以及PML ShRNAi，从而获得功能研究的初步模型。 结果:发现PML的有丝分裂期特异性的磷酸化位点(T409)，在有丝分裂阻滞的细胞中，PML蛋白T409位磷酸化水平是非同步化细胞的50倍以上。免疫荧光结果显示，T409位磷酸化的PML蛋白在间期和有丝分裂期都与经典的PML核体定位不同，这提示T409位磷酸化的PML蛋白亚群具有功能的特殊性。过表达显性负效应PMLT409A突变导致中期染色体高频率排列异常，并且在有丝分裂末期导致死亡。PML p409还能维持有丝分裂早中期进程并调节纺锤体检查点。缺失的PML p409能够造成早中期缩短，并导致纳克达唑诱导有丝分裂阻滞，产生更多的异倍体细胞。PMLT409A突变导致染色体在中期赤道板上高频率的错误排列，有丝分裂后期持续死亡。抑制PMLp409能够抑制肿瘤细胞的生长，暗示PML p409是癌症治疗潜在靶点。研究还发现，PML通过影响SUMO修饰而调控纺锤体检查点，这为深入研究PML调控有丝分裂的分子机制奠定了一定的工作基础。 结论:PML T409位(PML p409)磷酸化位点在有丝分裂期内特异性表达。PMLp409能够维持有丝分裂早中期时长并通过SUMO化调节纺锤体检查点。我们的结果暗示PML p409可以作为人类肿瘤潜在的临床作用靶点，揭示了PML作为肿瘤抑制基因发挥的抑癌作用机制。
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