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鞘脂是生物体必须的膜脂成分,目前研究显示,除了作为膜的结构成分,鞘脂作为信号分子参与了多种生物学过程如繁殖,发育,非生物胁迫和生物胁迫。在植物中,已有研究报道鞘脂做为生物活性分子参与抗性反应相关的程序性细胞死亡,但其具体作用机制还不清楚。拟南芥加速细胞死亡突变体acd5是一个神经酰胺激酶突变体,其在生长发育的晚期会出现自发的细胞死亡,且体内神经酰胺激酶的底物神经酰胺会积累到较高的水平。本文以植物鞘脂代谢途径中神经酰胺激酶突变体acd5为材料,采用细胞生物学和分子生物学方法,并结合LC-MS/MS对神经酰胺激酶突变体acd5的功能做了进一步的分析,为弄清植物中鞘脂,程序性细胞死亡以及植物抗性反应之间的关系提供重要的参考。
利用原生质体瞬时表达对ACD5蛋白的亚细胞定位进行分析,结果表明,神经酰胺激酶是一个多定位蛋白,如线粒体,高尔基,质膜等都有分布,但其主要定位在膜组分中。
利用LC-MS/MS比较分析野生型与突变体在发育过程中鞘脂含量的变化,我们发现,突变体中神经酰胺的含量随着生长逐渐增加,在40天时,突变体中神经酰胺的含量约是野生型中的6倍。而且,突变体中神经酰胺的积累与突变体的自发性细胞死亡的发展密切相关,同时伴随着自噬、程序性死亡和衰老相关基因的高水平表达。鞘脂代谢相关的基因表达分析揭示,突变体中神经酰胺的积累是由于神经酰胺合成酶的高表达和神经酰胺酶的低表达引起的。以上结果表明神经酰胺的积累在植物的程序性死亡过程中起着重要的作用。
接种灰霉菌后的鞘脂定量分析表明,无论是野生型还是突变体经过灰霉菌的侵染后,神经酰胺的含量起初都会逐步积累,野生型中第4天达到最高,第5天开始下降。与野生型相比,突变体中总神经酰胺的含量从第3天开始上升,第5天约是野生型的3倍。用定量PCR对抗性相关基因表达分析显示,几丁质酶和过氧化物酶基因(PRx33和PRx34)在野生型中被迅速诱导表达,而在突变体中被显著抑制。另外,抗性途径相关基因(PR1和植保素合成的关键基因(PAD3和CYP71A13)的表达在突变体中也被显著抑制。说明植物神经酰胺激酶的突变影响了植物的基础抗性和水杨酸抗性途径从而表现出对灰霉菌易感。
以上结果表明,植物体内神经酰胺的积累在植物程序性死亡和植物对灰霉菌的抗性反应起着重要的作用。