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目的：胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ES细胞）是从附置前早期胚胎内细胞团（ICM）或 附置后原始生殖细胞（Primordial germ cells, PGCs）分离克隆出来的一种具无限增殖能力和全向分化能力的干细胞。具有无限增殖和分化的潜能，在体外培养的条件下，加入饲养层或某些分化抑制因子，诱导分化因子，可以诱导其向特定的细胞方向分化，应用于基础实验研究或临床疾病治疗。Sertoli细胞可以分泌干细胞生长因子（SCF），而SCF对ES细胞有显著的分裂作用，能诱导干细胞进入细胞周期，提高转基因效率，而且SCF是干细胞生长的唯一调控因子，能控制胚胎发生过程中发育不同阶段的蛋白。另有报道认为SCF能通过抑制细胞凋亡而促进细胞的生长，可提高ES细胞培养和建系速率，为建立ES细胞系提供可靠基础。鉴于此，本项研究拟采用细胞培养、免疫组化、MTT分析等方法建立起稳定的小鼠成纤维细胞饲养层及Sertoli细胞饲养层，在此基础上，进行ES细胞的分离、培养，以比较Sertoli细胞饲养层和成纤维细胞饲养层的增殖生长情况及两种饲养层对ES细胞形态及生物学特性的影响。材料和方法：1原代成纤维细胞及Sertoli细胞<WP=4>的分离培养 选取昆明孕鼠（ 13.5－14.5dpc），分离胎鼠的表皮成纤维细胞，0.25％胰酶消化，37℃15min，低速离心，用含10％FCS的DMEM高糖培养基重悬细胞，调整细胞浓度，接种于培养瓶。选取16天左右的雄性小鼠5只，取其睾丸，去白膜，剪碎，0.25％胰酶及0.1％胶原酶消化，过200目网，低速离心，用含10％FCS的DMEM高糖培养基重悬细胞，调整细胞浓度，接种于培养瓶。2取长满单层细胞的盖玻片，进行HE染色，Giemsa染色,及免疫组织化学的方法检测Actin抗体在成纤维细胞和Sertoli细胞的表达情况。每种细胞分别选取3张切片，每张切片随机选5个视野，计数总细胞数和阳性细胞数，计算免疫组化阳性率，结果进行统计学处理。MTT法测生长曲线，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标作生长曲线，比较两种细胞的生长情况。3饲养层的制备 取生长良好的成纤维细胞及Sertoli细胞，吸掉培养基，加入新鲜配制的含10μg/ml丝裂霉素C的DMEM培养基，37℃孵育2.5－3小时。胰酶消化制备单细胞悬液，接种在明胶处理的四孔板。4 ES细胞的分离培养 取3.5－4.5dpc的孕鼠，剪开腹腔，用镊子夹取子宫角顶端，用圆头注射器吸取少量冲胚液，从一侧子宫角顶端注入冲胚液轻轻冲洗子宫角，用凹皿收集胚胎，移植入有饲养层的的四孔板中。4－5天后，将附着于培养皿底壁的生长良好、未分化现象的鸟巢状的小鼠内细胞团用灭菌玻璃针拨动，使其与滋养层细胞<WP=5>和成纤维细胞分离。再用消化液离散成小细胞团块，移入新制备的成纤维细胞和Sertoli细胞饲养层上，在37℃，5％CO2饱和湿度的CO2培养箱中孵育。5 ES细胞进行碱性磷酸酶染色，分别测定成纤维细胞和Sertoli细胞饲养层上ES细胞的生长曲线。并进行统计学处理。结果：1成纤维细胞及Sertoli细胞的生长状况及鉴定 成纤维细胞接种半小时后贴壁，可见细小突起长出，细胞呈梭形，核圆形。24小时后即可连生。刚刚分离出来的Sertoli细胞呈圆形，细胞贴壁后，可见Sertoli细胞伸出许多长的突起，细胞之间镶嵌排列。细胞呈大三角形或不规则形，核大而圆，核中央有1-2个大而明显的核仁。Sertoli细胞最突出的特征是胞质内可见透亮脂滴。 2 HE染色 成纤维细胞均匀分布，呈梭形，突起较长，核蓝紫色，核内可见染色质散在分布，胞质粉红色。Sertoli细胞稀疏分布，呈扁平多突起状，突起较短，核蓝紫色，核大而圆，核仁清楚，多为两个，胞质染色较浅，呈泡沫状。 Giemsa染色 成纤维细胞形态如上，核红色，胞质蓝色。Sertoli细胞形态如上，核呈红色，核内可见圆形卫星小体，位于核仁附近，直径较小，胞质紫色。 3 Actin免疫组化染色 Actin阳性反应呈棕黄色颗粒，分布于胞质内。成纤维细胞内未见棕黄色颗粒分布。Sertoli细胞胞质有大量棕黄色颗粒分布，阳性反应明显。统计结果显示 Sertoli细胞Actin免疫组化阳性率高于成纤维细胞，<WP=6>二者比较有显著差异（P<0.01）（见Table1 Fig.1）。 两种细胞生长曲线呈逐渐上升趋势，开始阶段成纤维细胞生长速度高于Sertoli细胞，5天后渐缓。而Sertoli细胞曲线呈缓和上升趋势，5天后仍继续上升, 统计学处理未见明显差异（P>0.05）。（见Table2 Fig.2）4 小鼠囊胚的生长行为 收集到的囊胚在培养（2－20）小时后，胚腔扩大，ICM集中于胚的一侧，绝大部分胚已脱去透明带，先后贴壁，附着在饲养层细胞表面，滋养层的细胞逐渐长出，推开饲养层细胞，同时ICM也开始增殖，培养4－5天后，ICM增大为圆柱样结构，其中有一小部分胚胎贴壁后增殖较小，不形成卵圆柱状结构。5 ES细胞生长状况 ES细胞集落样生长，集落边缘光滑清晰，有的集落边缘可见小的散在的ES细胞。细胞呈团状排列，每个细胞呈圆形，部分呈梭形，体积小，核大，胞浆少，可见一个或多个核仁。以成纤维细胞为饲养层的ES细胞，接种后集落呈圆形，较密集，集落周围有较多的小的ES细胞团或单个的ES细胞。细胞呈团状排列, 每个细胞呈圆形，部分呈梭形，体积小, 核大, 透亮。随培养时间的延?