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目的:结肠癌(colorectal cancer,CRC)的发病率和死亡率很高,研究发现饮食结构与癌症的发生密切相关,其中抗氧化剂在抑制肿瘤发生过程具有重要的作用。作为重要的抗氧化物质,原花青素在人们日常饮食结构中占有较高的比例,是药食同源的典型代表。原花青素是一类常见的多酚类物质,研究表明这类物质具有肿瘤防治功效,并且对人体毒副作用较低,提示其在肿瘤预防和治疗中具有重要的价值。本研究利用葡萄籽原花青素(Grape Seed Proanthocyanidins,GSPs)处理结肠癌细胞株 SW480 和 SW620(这两个细胞系来自于同一患者,其中SW480具有低转移性特点,而SW620具有高转移性的特点),检测其对细胞的生物学特征(细胞形态、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞EMT、细胞外泌体)的影响,随后采用二代测序技术,在两种细胞株中鉴定GSPs调控的基因,差异表达基因随后进行KEGG Pathway富集分析,探讨GSPs对结肠癌细胞SW480和SW620的作用分子机制,为结肠癌的预防治疗提供新的途径与实验依据。方法:1.细胞生物学特征的鉴定:(1)细胞形态观察,采用GSPs处理SW480和SW620细胞,观察其对细胞形态的影响;(2)细胞增殖能力检测,采用MTT法检测GSPs对细胞存活率的影响;(3)细胞周期和凋亡检测,利用流式细胞仪检测GSPs对两种细胞的影响。2.分子生物学鉴定:(1)上皮细胞-间充质转化(epithelial to mes-enchymal transition,EMT)相关的分子的鉴定,分别采用Western blotting以及实时定量PCR(Q-PCR)方法分别检测细胞本体以及外泌体中相关分子的表达,评估GSPs对EMT事件的影响。(2)两种细胞中GSPs调控基因的鉴定,GSPs分别处理两种细胞,利用二代测序技术检测细胞处理前后的转录组差异,通过生物信息学的分析,筛选出差异表达的基因,并对这些基因进行GO功能以及KEGG Pathway富集分析。(3)部分靶基因的验证,结合数据分析的结果,利用Q-PCR和Western blotting法分别检测GSPs处理前后信号通路相关分子的mRNA和蛋白表达水平,进而从机制上阐明GSPs对SW480和SW620的抑制作用。结果:GSPs作用于SW480和SW620细胞后,形态均发生明显改变,细胞发生膨胀,多呈圆形,周缘毛糙不规则。在短期时间(24h)内GSPs对SW480和SW620细胞的增殖具有促进作用,而在处理更长时间后(48 h、72 h),则具有抑制作用,细胞的存活率显著下降。GSPs可引起SW480和SW620细胞周期在G0/G1期发生阻滞,而且能够显著促进细胞的凋亡。GSPs对SW480和SW620细胞EMT也具有抑制作用,对应的分子变化显示,GSPs处理后两细胞的胞体以及外泌体里的E-cadherin的表达水平均升高,同时还发现外泌体中miRNA的表达量降低。差异表达基因筛选显示,超过200个差异基因涉及到Akt的通路,进一步对Akt通路相关的分子检测发现,GSPs处理不仅降低Akt的表达水平,同时也可抑制其磷酸化,同时可上调Bad、Bax、caspase 3和caspase 9 以及下调 Bcl-2、CyclinD1 和 CDK4结论:本研究通过细胞学特征的观察,发现GSPs对结肠癌细胞SW480和SW620的生物学特征有显著的影响,如:抑制细胞的增殖、EMT能力,造成细胞在G0/G1期发生阻滞,促进细胞凋亡。机制研究显示,GSPs可导致两种细胞多种基因表达的差异,其中Akt通路相关基因的改变具有一定的代表性,进一步对该通路研究显示,GSPs可不仅降低p-Akt的表达水平,同时也抑制Akt通路的激活。另外,GSPs可细胞增殖、EMT以及凋亡相关分子表达的显著差异。因此,本研究为结肠癌的预防和治疗提供新的途径与实验依据。