发酵法制备聚苹果酸

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聚苹果酸作为一类重要的完全生物降解高分子材料,其降解产物无毒无害,在医药、食品包装材料、吸水材料、化妆用品等领域具有重要的应用价值,并可用于制备优良的可降解塑料,甚至可以代替石油来源的不能被生物降解的聚丙烯酸的短期应用,存在着巨大的社会价值和商业利润。在国外,对于聚苹果酸的研究主要集中于化学合成法,成本高、操作条件苛刻、污染重,不符合环保意识不断增强的当代社会的发展趋势。在国内,对于聚苹果酸的研究非常少,几乎为空白。同化学合成法相比,微生物发酵法制备聚苹果酸具有无法比拟的优势:所需的原料简单易得,产物较纯,反应条件温和,产物分子量较高。但由于菌种的稳定性和产酸能力的原因,发酵法尚未形成产业规模。   本文对对出芽短梗霉BS02发酵产聚苹果酸进行了摇瓶培养研究,初步确立了出芽短梗霉制备聚苹果酸的发酵条件。优化的培养基组成为(g/L):葡萄糖120,丁二酸铵3,柠檬酸2,MgSO4·7H2O0.1,MnSO4·H2O0.1,玉米浆0.5(ml/L),CaCO35(单独灭菌加入),pH4.0。优化的摇瓶培养条件为:最适初始pH值为4.0,最适培养温度为25℃,种子的接种龄60h,接种量4%,装液量100/500mL,摇床转数220r/min。经实验考察聚苹果酸的最佳发酵时间为9d左右,最终聚苹果酸产量可达到30.5g/L。   通过采用B7L发酵罐进行放大培养,经多次发酵优化实验发现,补加一定质量的CaCO3将发酵液的pH值稳定在4.0-4.5,聚苹果酸的产量并没有比接种时一次性加入4%CaCO3有所提高。CaCO3为4%,通过补加葡萄糖使其在发酵液中的浓度为50g/L时,聚苹果酸的产量有所提高,但是效果并不明显。通气量为0.8vvm,转速700rpm时有利于菌体发酵合成PMLA,产量可以达到26.5克左右,低于摇瓶发酵的产量。   另外,经实验发现葡萄糖的存在对苹果酸的检测存在干扰,从而使聚苹果酸产量的计算存在误差。因此,在对苹果酸进行检测前应该对样品中的葡萄糖浓度进行检测。实验确定了葡萄糖对苹果酸测定影响的标准曲线方程,通过计算可以排除其对苹果酸检测造成的误差,进一步准确计算出聚苹果酸的含量。   对发酵液中聚苹果酸检测方法的优化,确定出聚苹果酸水解为苹果酸的的最   佳水解温度为80℃,水解时间为2h,以及用于水解的硫酸浓度为1mol/L。通过对发酵液中聚苹果酸提取方法的初步研究,确定了作为用以沉淀聚苹果酸的乙醇或甲醇的加入量为发酵液体积的3倍;甲醇的沉淀效果比乙醇的沉淀效果好;将发酵液的pH调节至5.0,有利于聚苹果酸的提取;PMLA粗品的干燥方法初步确定为室温自然干燥。采用GPC法初步测得发酵所得聚苹果酸的分子量大约为8396。
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