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溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是海洋环境中普遍存在的革兰氏阴性菌，作为海水养殖动物和人的机会致病菌，本实验室前期发现溶藻弧菌ZJ51呈现两种不同菌相的菌株，一种为光滑/透明菌落(Tr)，另外一种为粗糙/浑浊菌落(Op)。两种菌落的细菌在适应性、运动能力、生物膜以及致病力等许多方面存在显著差异，转录组分析发现不同菌相的菌株超过130个基因表达差异显著，结合其它弧菌中的相关研究，认为其中两个基因，细胞第二信使环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)控制基因cdgC和小RNA分子伴侣基因hfq，可能是溶藻弧菌菌相决定的关键调控因子，并构建了hfq基因的缺失突变株。 本研究在此基础上克隆了溶藻弧菌cdgC基因，构建了缺失突变，并比较了野生型与缺失株系的表型差异;同时根据转录组数据，分析获得了194个小RNA序列，通过荧光定量PCR对小RNA进行初步筛选和鉴定，并比较它们在不同菌株中的表达差异;初步预测了部分小RNA可能的调控目标序列和其它调控特征。结果如下: 1、根据NCBI中公布的溶藻弧菌12G01基因组序列，分别设计合成针对cdgC同源基因的引物对，以溶藻弧菌ZJ51基因组为模板进行PCR扩增，扩增片段进行测序鉴定后得到2188 bp的目的片段。cdgC的开放阅读框(openreading frame，ORF)长为1911 bp，编码637个氨基酸序列。序列分析表明，溶藻弧菌cdgC基因的开放阅读框核苷酸序列以及推导氨基酸序列与哈氏弧菌（Vibrio harveyi），副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），坎氏弧菌（Vibrio campbelli）等有较高的相似性。但与霍乱弧菌（Vibiro cholerae）等相似性较低。进化分析发现弧菌CdgC氨基酸序列可明显分为两个明显的分枝。一个进化枝包括溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌和坎氏弧菌等，其它菌株则被分到另外一个进化枝中。 2、利用同源基因重组技术，成功构建了溶藻弧菌ZJ51两种菌相的cdgC基因缺失突变株△cdgC-T和△cdgC-O。通过比较野生型菌株和cdgC突变菌株表型和生理生化实验比较，发现缺失菌株在固体培养基上的菌落形态与其各自野生型无明显变化，它们的运动能力、鞭毛合成水平和胁迫环境下的生长情况基本相似，缺失cdgC使生物膜形成能力下降;而BIOLOG表型微芯片分析(PhenotypicMicroarray)发现在两种菌相背景下，cdgC缺失后都大大降低了对D-麦芽糖、L-丙氨酸和β-羟基-苯乙酸的利用效率，同时在Tr表型中，CdgC缺失后还增加了对肌醇、D-海藻糖和L-乳酸等碳源利用效率，但在Op表型中，受影响的主要是硫酸四癸钠、D-乳酸甲酯、L-半乳糖醛酸内酯和D-苹果酸。这些数据说明溶藻弧菌菌落相变影响了cdgC基因的调控，但可能并不是菌落相变的决定性因子。 3、通过转录组分析初步筛选出194个表达的小RNA，随机挑选11个小RNA，通过荧光定量PCR分析了它们的表达，结果发现有8个小RNA能够在至少其中的一株细菌中得到特异性的扩增，表明转录组分析潜在小RNA阳性率是较高的;对比不同背景下野生型与hfq突变株中的表达发现，ZJ-T缺失了hfq之后，misc_ RNA-13、misc_ RNA-66、misc_ RNA-81、misc_ RNA-114、misc_ RNA-155、misc RNA-164的表达量均降低，misc_ RNA-52的表达量上调;ZJ-O缺失了hfq之后，misc_RNA-52、misc_ RNA-66、misc_ RNA-105、misc_ RNA-155、misc_ RNA-164的表达量均上调。说明Hfq对于这些小RNA的稳定性起关键作用，而且部分小RNA的表达也受菌相调控。 4、分析了三个小RNA的种系发生，用RNAPredator2分析了三个小RNA调控的目标基因，发现misc RNA-13在溶藻弧菌基因组中有6个高度同源的序列，而且在其它弧菌基因组中也存在多个类似的同源序列，靶基因分析发现，该小RNA可能调控转运蛋白、氧化还原蛋白以及菌毛合成相关蛋白的合成等;而misc RNA-105调控蛋白主要包括鞭毛和菌毛合成相关蛋白、表面多糖合成以及细胞色素等产能系统的蛋白表达;misc RNA-114调控的目标基因可能包括细菌密度感应系统、碳水化合物转运蛋白以及多重药物排出泵等。 综合以上研究结果，推测CdgC不是溶藻弧菌菌落相变的决定因子，但广泛影响细菌对不同碳源的代谢，并受到菌落相变调控。而Hfq及相关小RNA可能是决定菌相的决定因子，但对于这些小RNA的功能及其调控机制还需要进一步研究。