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研究背景重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis,SAP)病情重,并发症多,常释放大量炎症介质诱发全身系统性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),导致肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和严重感染等多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)[’1,2],病死率很高。SAP的临床治疗包括保守治疗或手术治疗,大量临床研究证实,外科治疗因为手术的创伤和应激反应会加重胰腺局部和全身的炎症反应,而且会继发严重感染,引起肺、肝、肾、心等器官的功能衰竭,病死率较高[3]。近年来我国重症急性胰腺炎的发病率升高,但缺乏有效的治疗手段来提高患者治愈率及存活率,因此重症急性胰腺炎的发病机制和治疗方法是目前临床研究的国际性难题。重症急性胰腺炎是一个多因素参与的复杂的病理生理过程[4],目前的研究表明,SAP发病的主要机制是:胰酶对胰腺的自身消化、肠道细菌移位、炎症细胞过度激活、钙超载、胰腺循环障碍和高脂血症等。胰腺内各种消化酶原被激活,诱导大量炎症细胞持续释放各种细胞因子,触发连续的炎症介质瀑布样级联反应,一系列的炎症反应导致多器官功能障碍[5]。胰腺作为原发器官,往往是受损最为严重的器官。肺作为SIRS最常见的靶器官,是最容易受累的器官,肺损伤是SAP最常见并发症之一。Bonjoch Le等[6]研究发现,采用牛磺酸诱导急性胰腺炎大鼠模型,肺泡巨噬细胞激活,炎性细胞浸润,出现急性胰腺炎相关性肺损伤。近几年的研究表明,炎症因子的持续过度释放是造成SAP病情恶化的主要因素之一。因此,SAP的临床治疗的重点是降低炎症反应、控制炎症介质瀑布样级联反应、维持促炎和抗炎反应的平衡,阻断SIRS引起的MODS。所以阻断SAP的炎症信号转导通路、抑制炎症因子的表达是目前研究和治疗的关键靶点。血红素加氧酶-1(HO-1),是血红素降解的限速酶,也被称为热休克蛋白-32(HSP-32),具有保护细胞、减轻氧化应激对细胞损伤的作用[7]。HO-1还具有影响细胞生长、炎症反应和凋亡等作用。一些动物实验证实,HO-1具有降低炎症反应的作用,能够减少组织细胞对不同促炎因子导致的炎症反应所引起的组织损伤[8]。在一些动物实验中,给予脂多糖(LPS)建立脓毒症模型,缺乏HO-1基因的大鼠和给予HO-1抑制剂的大鼠,器官损伤增加,死亡率升高[9-10]。这些研究表明,在缺血再灌注损伤中,在降低脓毒症模型的氧化应激反应中,在低氧环境中,HO-1在调控氧化应激、炎症反应等方面发挥重要的作用,并具有器官保护作用,HO-1具有可诱导的抗炎和器官保护作用[11-14]。TNF-α和L-10是体内重要的促炎和抗炎细胞因子,IL-10可抑制IL-2、IL-3及TNF-α等细胞因子的合成,还可以抑制TNF-α释放而减轻炎症反应、保护脏器功能,具有潜在的抗炎功能,对SAP所致的MODS有保护作用。TNF-α是由淋巴细胞以及巨噬细胞所分泌的炎症因子,释放后能诱导IL-2、IL-3、IL-6、IL-8及TNF-a的表达,导致炎性因子过度的表达和释放,过度的炎症反应导致细胞损伤和组织破坏[15-17]。近几年的一些研究发现,HO-1可调控IL-10的表达,介导IL-10的抗炎效果[18]。在小鼠巨噬细胞中,IL-10可通过p38-MAPK信号传导通路诱导HO-1的表达[19]。在LPS引起的脓毒性休克小鼠模型中,IL-10介导的抗炎作用可以被HO-1抑制剂ZnPP所减弱。近年来的研究发现,诱导HO-1基因表达与多条信号转导通路有关,而且各种炎症信号刺激通过不同的炎症信号传导通路诱导HO-1基因的表达。诱导HO-1基因表达的炎症信号传导通路可分为:(1)p38/MAPK炎症信号传导通路;(2)PI3K/AKT炎症信号传导通路(转录后水平的调节);(3)JAK/STAT炎症信号传导通路;(4)蛋白激酶途径的调节。其中促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)炎症信号传导通路被研究证实可以诱导HO-1基因的表达。但HO-1的激活对p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路的调节作用未见国内外研究报道,值得进一步研究证实,以指导临床应用。图1.HO-1及其相关p38 MAPK/NF-KB信号通路示意图在SAP中,HO-1的表达对促炎因子TNF-a、抑炎因子IL-10是否具有调节作用,对胰腺和肺是否具有器官保护作用,以及HO-1是否通过p38 MAPK/NF-KB炎症信号传导通路发挥调节炎症反应和器官保护作用,尚无定论。如果能从炎症信号传导通路阻断过度激活的全身炎症反应,将为SAP的临床治疗提供有力的武器。(国家自然基金课题(81503543)项目)目的观察血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)过表达及抑制对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠血清、胰腺和肺组织HO-1、促炎因子TNF-aα抑炎因子IL-10含量的变化,以及对胰腺和肺组织病理学的影响,分析血红素加氧酶-1对胰腺和肺炎症反应的器官保护作用;观察HO-1过表达及抑制对SAP大鼠胰腺和肺组织p3 8 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路的调节作用,探讨HO-1抗炎作用以及对胰腺和肺器官保护作用的炎症信号传导通路机制。方法60只雄性SD大鼠,6～7周龄,220～260 g,随机分为4组:对照组、SAP模型组、HO-1抑制剂组、HO-1过表达组,每组15只。1、对照组:假手术组,只开腹,然后关腹,腹腔注射生理盐水,10ml/kg。2、SAP模型组:采用开腹经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠(0.1ml/100g)方法制备SAP模型,建模后腹腔注射生理盐水,10ml/kg。3、HO-1抑制剂组:经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠(0.1ml/100g)方法制备SAP模型,制备SAP模型后30min腹腔注射HO-1抑制剂锌原卟啉(Zn-protoporphyrin,Zn-PP),20μxmol/kg。4、HO-1过表达组:经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠(0.1ml/100g)方法制备SAP模型,制备SAP模型后30 111min腹腔注射1HO-1促进剂血晶素,75μg/kg。在制模后24 h处死大鼠,腹主动脉留取血液标本,留取胰腺、肺组织标本。制备胰腺和肺组织石蜡切片,用HE(hematoxylin-eosin)染色法观察胰、肺组织病理学改变,进行组织病理学评分。应用免疫组织化学技术(免疫荧光法)对切片进行染色,观察促炎因子TNF-α、抗炎因子IL-10的细胞内表达情况。酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清TNF-α IL-10、HO-1含量。制备胰腺和肺组织匀浆,离心提前上清液,ELISA法检测其中TNF-α IL-10、HO-1的含量。提取胰腺和肺组织的总蛋白,Western Blot法检测p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白(p38 MAPK、磷酸化P38 MAPK、MAPKAPK2、NF-1κB p65)的表达水平。结果一、各组大鼠血清HO-1、IL-10、TNF-a含量的比较1、各组大鼠的血清HO-1含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清HO-1含量明显增高(0.85±0.14vs 0.28±0.03,P<0.01);与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的血清HO-1显著下降(0.75±0.11 vs 1.02±0.16,P<0.01);与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的血清HO-1含量显著增高(1.02±0.16 vs 0.85±0.14,P<0.01)。2、各组大鼠的血清IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清IL-10含量均明显增高(71.89±8.91 vs 11.05±1.79,P<0.01);与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的血清IL-10含量显著下降(64.55±7.69 vs 99.83±13.33,P<0.01);与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的血清IL-10含量显著增高(99.83±13.33 vs 71.89±8.91,P<0.01)。3、各组大鼠的血清TNF-a含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清TNF-α含量明显增高(29.26±3.69 vs 12.53±2.04,P<0.01);与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的血清TNF-α含量显著升高(34.36±3.95 vs 21.69±2.95,P<0.01);与SAP模型组相比,HO-1过表达组TNF-α含量显著下降(21.69±2.95 vs 29.26±3.69,P<0.01)。二、各组大鼠胰腺组织中HO-1、IL-10、TNF-α含量的比较1、各组大鼠的胰腺HO-1含量比较.:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺HO-1含量明显增高(0.52±0.08 vs 0.18±0.02,P<0.01);与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的胰腺HO-1含量显著下降(0.37±0.06 vs 0.82±0.12,P<0.01);与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的胰腺HO-1含量明显增高(0.82±0.12 vs 0.52±0.08,P<0.05)。2、各组大鼠的胰腺IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺IL-10含量明显增高(52.63±6.02 vs 26.37±3.57,P<0.01);与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的胰腺IL-10含量显著下降(48.09±6.22 vs 62.7±9.11,P<0.01);与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的胰腺IL-10含量明显增高(62.71±9.11 vs 52.63±6.02,P<0.05)。3、各组大鼠的胰腺TNF-a含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺TNF-a含量明显增高(31.76±5.52 vs 14.78±2.39,P<0.01);与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的胰腺TNF-α含量明显升高(34.17±5.16 vs 25.68±3.49,P<0.05);与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的胰腺TNF-α含量明显下降(25.68±3.49 vs 31.76±5.52,P<0.05)。三、各组大鼠肺组织中HO-1、IL-10、TNF-α含量的比较1、各组大鼠的肺组织HO-1含量比较.:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中HO-1含量明显增高(0.46±0.06 vs 0.09±0.01,P<0.01);与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的肺组织中HO-1含量显著下降(0.33±0.05 vs 0.79±0.11,P<0.01);与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的肺组织中HO-1含量明显增高(0.79±0.11 vs 0.46±0.06,P<0.05)。2、各组大鼠的肺组织IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中IL-10含量明显增高(49.18±6.80 vs 19.51±2.92,P<0.01);与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的肺组织中IL-10含量显著下降(44.72±6.67 vs 58.34±7.81,P<0.01);与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的肺组织中IL-10含量明显增高(58.34±7.81 vs 49.18±6.80,P<0.05)。3、各组大鼠的肺组织TNF-α含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中TNF-α含量明显增高(29.61±3.89 vs 11.36±1.64,P<0.01);与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的肺组织中TNF-α含量明显升高(35.06±4.92 vs 22.58±3.32,P<0.05);与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的肺组织中TNF-α含量明显下降(22.58±3.32 vs 29.61±3.89,P<0.05)。四、各组大鼠胰腺组织病理学和免疫组化切片观察:1、胰腺大体标本观察:对照组胰腺组织无水肿、充血、及胰腺坏死,未见明显病理变化;SAP模型组胰腺组织水肿、苍白,表面脂肪组织散在点状皂化斑;HO-1抑制剂组胰腺组织明显水肿、苍白,表面脂肪组织散在点状皂化斑;HO-1过表达组胰腺组织局部水肿、苍白,未发现明显皂化斑。2、光镜下观察:对照组胰腺腺泡排列规则,腺管形态正常,未见明显变化;SAP模型组胰腺间质不同程度的充血、水肿,伴有炎症细胞浸润,胰腺部分出血、坏死,腺泡水肿、排列紊乱;HO-1抑制剂组胰腺间质明显充血、水肿,大量炎症细胞浸润,胰腺大片出血、坏死,腺泡水肿、排列紊乱,与模型组比较,病变较重;HO-1过表达组胰腺间质轻度水肿,少量炎症细胞浸润,小叶间隔增宽,与模型组比较,病变较轻。3、胰腺组织病理学评分:与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高(13.50±0.76 vs 7.00±0.49,P<0.01),与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的胰腺组织病理评分明显降低(7.00±0.49 vs 11.50±0.53,P<0.05);有显著统计学差异。4、各组大鼠胰腺组织IL-10免疫组化检测结果:对照组细胞内IL-10表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较对照组明显;HO-1抑制剂组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显;HO-1过表达组细胞内IL-10表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显。5、各组大鼠胰腺组织TNF-α免疫组化检测结果:对照组细胞内TNF-α表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内TNF-a表达增加,免疫组化染色较对照组明显;HO-1抑制剂组细胞内TNF-α表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显;HO-1过表达组细胞内TNF-α表达较少,免疫组化染色较SAP模型组少。五、各组大鼠肺组织病理学和免疫组化切片观察:1、大体标本观察:对照组大鼠肺无水肿、充血,表面红润,气管内无渗出液。SAP模型组大鼠肺明显水肿、充血,表面苍白,包膜下可见渗血,气管内较多渗出液。HO-1抑制剂组大鼠肺明显水肿、充血,表面苍白,包膜下较多渗血,气管内大量渗出液,病变较SAP模型组大鼠重。HO-1过表达组大鼠肺可见水肿、充血,较SAP模型组大鼠轻,表面苍白,包膜下少量渗血,气管内少量渗出液。2、HE染色光镜下观察:对照组大鼠肺组织结构完整、清晰,细胞排列规整,无炎性细胞浸润;肺泡壁薄,无充血、水肿,肺泡内无渗出液。SAP模型组大鼠肺组织结构模糊,大量炎性细胞浸润,少量红细胞渗出;肺泡壁增厚,明显充血、水肿,肺泡内大量渗出液,富含蛋白,透明膜形成。HO-1抑制剂组大鼠肺组织结构模糊,大量炎性细胞浸润,可见红细胞渗出;肺泡壁显著充血、水肿,肺泡内大量渗出液,富含蛋白,透明膜形成,上皮细胞脱落,渗出较SAP模型组增加,病变明显加重。HO-1过表达组大鼠肺组织结构较完整,少量炎性细胞浸润,偶见红细胞渗出;肺泡壁轻度充血、水肿,肺泡内少量渗出液,富含蛋白,渗出较SAP模型组减轻,病变较轻。3、肺组织病理学评分:HO-1抑制剂组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高(12.28±0.83 vs 9.37±0.61,P<0.05);与HO-1 过表达组相比,HO-1 抑制剂组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高(12.28±0.83 vs 5.53±0.57,P<0.01);与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的肺组织病理评分明显降低(5.53±0.57 vs 9.37±0.61,P<0.05),有显著统计学差异。4、各组大鼠肺组织IL-10免疫组化检测结果:对照组细胞内IL-10表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较对照组明显;HO-1抑制剂组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显;HO-1过表达组细胞内IL-10表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显。5、各组大鼠肺组织TNF-α免疫组化检测结果:对照组细胞内TNF-α表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内TNF-α表达增加,免疫组化染色较对照组明显;HO-1抑制剂组细胞内TNF-α表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显;HO-1过表达组细胞内TNF-α表达较少,免疫组化染色较SAP模型组少。六、各组大鼠胰腺组织中p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白的表达水平Western Blot检测结果显示,HO-1抑制剂可增加胰腺组织中p38的磷酸化、MAPKAPK2的表达,促进NF-KB p65的表达;HO-1过表达可抑制SAP大鼠胰腺组织p38的磷酸化、MAPKAPK2的表达,减少NF-κB p65的表达。七、各组大鼠肺组织中p38 MAPK/NF-KB通路关键蛋白的表达水平Western Blot检测结果显示,HO-1抑制剂可增加SAP大鼠肺组织中p38的磷酸化、MAPKAPK2的表达,促进NF-κκB p65的表达;HO-1过表达可抑制SAP大鼠肺组织p38的磷酸化、MAPKAPK2的表达,减少NF-κB p65的表达。Western Blot检测结果提示p38 MAPK/NF-KB传导通路可能是HO-1增加IL-10、降低TNF-α减轻SAP大鼠过度炎症反应的关键炎症信号传导通路。结论1、HO-1过表达可以降低SAP大鼠炎症因子的释放,减轻组织炎症反应,对SAP大鼠的胰腺和肺组织具有器官保护作用;2、HO-1对SAP大鼠胰腺和肺组织保护作用的机制可能与增加IL-10表达、降低TNF-α的表达有关。3、HO-1过表达可抑制SAP大鼠胰腺和肺组织p38 MAPK的磷酸化,减少NF-κB p65的表达。4、实验提示p38 MAPK/NF-KB传导通路可能是HO-1减轻SAP大鼠过度炎症反应的关键炎症信号传导通路。前言重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis,SAP)的临床治疗包括保守治疗或手术治疗。大量临床研究已经证实,外科治疗因为手术的创伤和应激反应会加重胰腺局部和全身的炎症反应,而且会继发严重感染,引起肺、肝、肾、心等器官的功能衰竭,病死率较高。近年来我国重症急性胰腺炎的发病率升高,但缺乏有效的治疗手段来提高患者治愈率及存活率,因此重症急性胰腺炎的治疗是国际性难题。中医药是我国传统文化的瑰宝,中西医结合治疗是我国的特色和优势所在。中医药治疗SAP具有独特的疗效,已成为SAP临床治疗方案中的重要组成部分。医圣汉代张仲景所著《伤寒杂病论》中的经典方剂大柴胡汤在胰腺炎的临床治疗中应用最多,临床疗效较为明显[1]。大柴胡汤是仲景名方,为表里双解剂,具有和解少阳,内泻热结之功效,主治少阳阳明合病W。临床常用于治疗消化性溃疡、急性胰腺炎、胆结石、急性胆囊炎等病症。近年来临床研究和动物实验发现,该方剂具有多种药理作用,可以抑制胃酸过多分泌以保护胃黏膜,还能松弛奥狄氏括约肌张力,具有利胆作用,还有保护肝细胞等作用[3]。大柴胡汤治疗SAP的临床疗效值得期待,其作用机制尚不明确,需要实验研究来加以证实和阐明,也将为临床应用提供实验证据的支持。TNF-α和IL-10是体内重要的促炎和抗炎细胞因子,IL-10可抑制IL-2、IL-3及TNF-α等细胞因子的合成,还可以抑制TNF-α释放而减轻炎症反应、保护脏器功能,具有潜在的抗炎功能,对SAP所致的多器官损伤有保护作用[4,5]。TNF-α是由淋巴细胞以及巨噬细胞所分泌的炎症因子,释放后能诱导IL-2、IL-3、IL-6、IL-8及TNF-a的表达,导致炎性因子过度的表达和释放,过度的炎症反应导致细胞损伤和组织破坏[6-8]。在第一部分SAP大鼠动物实验中已经证实,HO-1可以促进抑炎因子IL-10的表达、减少促炎因子TNF-α的表达,对胰腺和肺具有器官保护作用,HO-1调节p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路发挥抑制炎症反应和器官保护作用。大柴胡汤如果能通过调节HO-1抑制p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路阻断过度激活的全身炎症反应,将为SAP的临床治疗提供新的治疗靶点。大柴胡汤治疗SAP的临床疗效及其作用机制尚需实验研究来加以证实和阐明,本实验应用大柴胡汤来治疗SAP大鼠模型,观察其对大鼠血清、胰腺和肺组织炎症因子HO-1、TNF-α、IL-10含量的影响,以及对胰腺和肺组织病理学的影响,探讨大柴胡汤对胰腺和肺保护作用;观察大柴胡汤对SAP大鼠胰腺和肺组织p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路的调节作用,分析大柴胡汤治疗SAP是否通过介导HO-1/p38 MAPK/NF-KB炎症信号传导通路发挥抗炎作用以及器官保护作用。如果能阻断过度激活的全身炎症反应,将为SAP的临床治疗提供有力的武器,具有重要的临床意义。目的观察中药大柴胡汤(Dachaihu Decoction)对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠血清、胰腺和肺组织HO-1、TNF-α、IL-10的影响,以及对胰腺和肺组织病理学的影响,探讨大柴胡汤对胰腺和肺炎症反应的保护作用;观察大柴胡汤对SAP大鼠胰腺和肺组织p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路的调节作用,分析大柴胡汤治疗SAP是否通过介导HO-1/p38 MAPK/NF-KB炎症信号传导通路发挥抗炎作用以及器官保护作用。方法45只雄性SD大鼠,6～7周龄,220～260 g,随机分为3组:对照组、SAP模型组、大柴胡汤组,每组15只。1、对照组:假手术组,只开腹,然后关腹。术后给予2ml生理盐水灌胃,每天两次,自由饮水。2、SAP模型组:采用开腹经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠(0.1ml/100g)方法制备SAP模型,建模后大鼠给予2ml生理盐水灌胃,每天两次,自由饮水。3、大柴胡汤组:经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠(0.1ml/1OOg)方法制备SAP模型,制备SAP模型后给予大鼠中药大柴胡汤灌胃(2ml/200g,BID,剂量按公式计算)。大柴胡汤配方:柴胡15g,黄芩9g,芍药9g,枳实9g,半夏9g,大黄6g,大枣5枚(约10g),生姜15g,总计82g。大柴胡汤由山东中医药大学附属医院中药房煎药室煎制,熬成200ml药液,大鼠以200g为标准体重计算,给予2ml中药灌胃,每天两次,给药量相当于含生药8.2g/(kg·d)。大鼠的用药剂量计算公式:dB=dA× RB/RA×(WA/WB)1/3。公式中dA为人每公斤体重给予的剂量,dB为大鼠每公斤体重给予的剂量,单位为mg/kg,RA=100,为人的体型系数,RB=59,为大鼠的体型系数,WA、WB分别为人和大鼠的体重值,单位为kg。人的标准体重以60kg计算,大鼠标准体重以200g计算,求得所给予剂量[9]。在制模后72h腹主动脉穿刺留取血液标本,放尽血液处死大鼠,然后留取胰腺、肺组织标本。酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清TNF-α、IL-10、HO-1含量。制备胰腺和肺组织匀浆,离心提前上清液,ELISA法检测其中TNF-α、IL-10、HO-1的含量。制备胰腺组织石蜡切片,用HE(hematoxylin-eosin)染色法观察胰、肺组织病理学改变,进行组织病理学评分。应用免疫组织化学技术(免疫荧光法)对切片进行染色,观察促炎因子TNF-α、抗炎因子IL-10的细胞内表达情况。提取胰腺和肺组织总蛋白,Western Blot法检测p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白(p38 MAPK、磷酸化P38 MAPK、MAPKAPK2、NF-KB p65)的表达水平。结果一、各组大鼠的血清HO-1、IL-10、TNF-α含量比较1、各组大鼠的血清HO-1含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清HO-1含量显著增高(0.82±0.17 vs 0.26±0.05,P<0.01);与SAP模型相比,大柴胡汤组血清HO-1 明显增高(0.99±0.15 vs 0.82±0.17,P<0.05)。2、各组大鼠的血清IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清IL-10含量均显著增高(74.62±7.28 vs 12.37±1.94,P<0.01);与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的血清IL-10含量明显增高(91.67±10.53 vs 74.62±7.28,P<0.05)。3、各组大鼠的血清TNF-α含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清TNF-α含量明显增高(31.49±4.67 vs 11.73±1.88,P<0.01);与SAP模型组相比,大柴胡汤组TNF-α含量明显下降(23.81±3.29 vs 31.49±4.67,P<0.05)。二、各组大鼠的胰腺HO-1、IL-10、TNF-α含量比较1、各组大鼠胰腺的HO-1含量比较.:与对照组相比,SAP模型组大鼠胰腺的HO-1含量显著增高(0.49±0.07 vs 0.17±0.04,P<0.01);与SAP模型相比,大柴胡汤组胰腺HO-1 明显增高(0.78±0.14 vs 0.49±0.07,P<0.05)。2、各组大鼠的胰腺IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺IL-10含量明显增高(50.37±4.56 vs 25.93±2.86,P<0.01);与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的胰腺IL-10含量明显增高(59.82±6.35 vs 50.37±4.56,P<0.05)。3、各组大鼠的胰腺TNF-a含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺TNF-a含量明显增高(31.76±5.52 vs 14.78±2.39,P<0.01);与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的胰腺TNF-α含量明显下降(25.68±3.49 vs 31.76±5.52,P<0.05)。三、各组大鼠的肺组织HO-1、IL-10、TNF-α含量比较1、各组大鼠肺组织的HO-1含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠肺组织的HO-1含量显著增高(0.42±0.07 vs 0.13±0.02,P<0.01);与SAP模型相比,大柴胡汤组肺组织HO-1 明显增高(0.65±0.09 vs 0.42±0.07,P<0.05)。2、各组大鼠的肺组织IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中IL-10含量明显增高(48.51±3.94 vs 20.63±1.89,P<0.05);与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的肺组织中IL-10含量明显增高(57.26±6.07 vs 48.51±3.94,P<0.05)。3、各组大鼠的肺组织TNF-a含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中TNF-a含量明显增高(28.43±2.92 vs 10.67±0.94,P<0.05);与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的肺组织中TNF-α含量明显下降(10.67±0.94 vs 28.43±2.92,P<0.05)。四、各组大鼠胰腺形态学观察:1、胰腺大体标本观察:对照组胰腺组织无水肿、充血、及胰腺坏死,未见明显病理变化;SAP模型组胰腺组织水肿、苍白,表面脂肪组织散在点状皂化斑;大柴胡汤组胰腺组织局部水肿、苍白,未发现明显皂化斑。2、光镜下观察:对照组胰腺腺泡排列规则,腺管形态正常,未见明显变化;SAP模型组胰腺间质不同程度的充血、水肿,伴有炎症细胞浸润,胰腺部分出血、坏死,腺泡水肿、排列紊乱;大柴胡汤组胰腺间质轻度水肿,少量炎症细胞浸润,小叶间隔增宽,与模型组比较,病变较轻。3、胰腺组织病理学评分:与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的胰腺组织病理评分明显降低(8.50±0.78 vs 12.30±1.26,P<0.05);与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高(12.30±1.26vs0,P<0.01)。4、各组大鼠胰腺组织IL-10免疫组化检测结果:对照组细胞内IL-10表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较对照组明显;大柴胡汤组细胞内IL-10表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显。5、各组大鼠胰腺组织TNF-α免疫组化检测结果:对照组细胞内TNF-α表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内TNF-α表达增加,免疫组化染色较对照组明显;大柴胡汤组细胞内TNF-α表达较少,免疫组化染色较SAP模型组少。五、各组大鼠肺组织病理学观察:1、大体标本观察:对照组大鼠肺无水肿、充血,表面红润,气管内无渗出液。SAP模型组大鼠肺明显水肿、充血,表面苍白,包膜下可见渗血,气管内较多渗出液。大柴胡汤组大鼠肺可见水肿、充血,较SAP模型组大鼠轻,表面苍白,包膜下少量渗血,气管内少量渗出液。2、HE染色光镜下观察:对照组大鼠肺组织结构完整、清晰,细胞排列规整,无炎性细胞浸润;肺泡壁薄,无充血、水肿,肺泡内无渗出液。SAP模型组大鼠肺组织结构模糊,大量炎性细胞浸润,少量红细胞渗出;肺泡壁增厚,明显充血、水肿,肺泡内大量渗出液,富含蛋白,透明膜形成。大柴胡汤组大鼠肺组织结构较完整,少量炎性细胞浸润,偶见红细胞渗出;肺泡壁轻度充血、水肿,肺泡内少量渗出液,富含蛋白,渗出较SAP模型组减轻,病变较轻。3、肺组织病理学评分:与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的肺组织病理评分明显降低(5.35±0.49 vs 8.93±0.85,P<0.05);与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高(8.93±0.85 vs 0,P<0.01)。4、各组大鼠肺组织IL-10免疫组化检测结果:对照组细胞内IL-10表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较对照组明显;大柴胡汤组细胞内IL-10表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显。5、各组大鼠肺组织TNF-α免疫组化检测结果:对照组细胞内TNF-a表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内TNF-α表达增加,免疫组化染色较对照组明显;大柴胡汤组细胞内TNF-α表达较少,免疫组化染色较SAP模型组少。六、各组大鼠胰腺组织中p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白的表达水平Western Blot检测结果显示,对照组大鼠胰腺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化、NF-KB p65的表达正常。SAP组大鼠胰腺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化、NF-κB p65的表达明显增加。大柴胡汤可抑制SAP大鼠胰腺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化,抑制NF-κB p65的表达。七、各组大鼠肺组织中p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白的表达水平Western Blot检测结果显示,对照组大鼠肺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化、NF-κB p65的表达正常。SAP组大鼠肺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化、NF-κB p65的表达明显增加。大柴胡汤可抑制SAP大鼠肺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化,抑制NF-KB p65的表达。结论1、大柴胡汤治疗SAP大鼠可增加HO-1表达,减轻炎症反应,明显减轻胰腺及肺组织病理改变。2、大柴胡汤可抑制SAP大鼠胰腺和肺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化,抑制NF-κB p65的表达。3、大柴胡汤对SAP大鼠胰腺和肺组织保护作用的机制可能与诱导HO-1表达升高IL-10、降低TNF-a有关。4、p38 MAPK/NF-κB通路可能是大柴胡汤诱导HO-1表达发挥抗炎和器官保护作用的关键炎症信号传导通路。