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背景随着环境的改变、药物的使用、肿瘤发病率的增加、老年患者肾活检量增加,肾炎病理疾病谱发生了巨大变化。膜性肾病(membranous nephropathy, MN)在肾炎肾活检中所占的比率也逐年升高,根据上海交通大学附属瑞金医院统计从2000年的7.1%升至2009年的22.7%。王海燕教授研究表明,在总人群中,膜性肾病已经成为继IgA肾病(IgA nephropathy, IgAN)之后的第二大病理类型。在大于60岁的老年人群中,膜性肾病是最常见的病理类型。在过去的半个世纪中,肾脏病学家在膜性肾病发病机制方面做了许多努力,包括成功制造Heymann’s膜性肾病动物模型以及发现中性肽链内切酶(NEP)参与儿童膜性肾病发病等。2009年,Beck等人在大约70%特发性膜性肾病患者血清中发现抗M-型磷脂酶A2受体(PLA2R1)抗体,提出该抗原是特发性膜性肾病(Idiopathic membranous nephropathy, IMN)的主要靶抗原。随后PLA2R1受到了越来越多肾脏病学家的关注。我国人群基因、饮食习惯、环境均异于国外,并且关于我国IMN肾组织PLA2R1抗原的研究鲜有报道。在我国,IgA肾病占原发性肾小球疾病的45%-50%,是我国人群中最常见的肾小球肾炎,同时也是世界范围内最常见的原发性肾小球疾病。血清IgA/C3比值作为一个简单的检测指标,在IgA肾病诊断中价值尚未形成定论。并且关于血清IgA/C3比值与IgAN的病理间的关系研究较少。目的1.检测我国IMN患者肾组织PLA2R1抗原的表达,探讨其肾组织PLA2R1抗原表达与血清该抗体表达阳性率的差异。2.评价血清IgA/C3比值在IgAN诊断预测中的价值及其与IgAN病理之间的关系。方法1.成人特发性膜性肾病患者肾组织PLA2R1抗原及血清抗PLA2R1抗体的检测1.1 研究对象选取2010年5月至2014年5月于南方医科大学第三附属医院肾内科行肾活检证实的成人IMN、其他肾小球疾病及继发性膜性肾病患者共114例,包括IMN41例、乙型肝炎病毒相关性膜性肾病(HBV-MN)8例、V型狼疮肾炎(LN)8例、IgA肾病27例、微小病变性肾病(MCD)19例、轻度系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)5例、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)6例。IMN的诊断是根据肾活检病理诊断为膜性肾病,经详细的询问病史及相关实验室检查排除由系统性红斑狼疮、乙型肝炎病毒、肿瘤等继发性膜性肾病。本研究所纳入的病例临床上均未长期使用免疫抑制剂或(和)糖皮质激素治疗,所有肾活检均经患者知情同意。1.2标本采集及方法B超声引导下行肾活检穿刺,常规行光镜、免疫荧光和电镜检测。采用直接免疫荧光法对新鲜冰冻组织常规进行IgA、IgM、IgG、C3、C4、Clq染色。对石蜡组织行HE染色、PAS染色、PASM染色、MASSON染色。我们使用石蜡包埋组织组织采用间接免疫荧光法,检测IMN、继发性膜性肾病及其他肾小球疾病肾组织PLA2R1抗原。收集血清标本：留取肾活检当日清晨空腹静脉血,所有标本均采血5 mI,置于促凝剂试管中,凝固后使用离心机离心8min,转速为3000r/min,分离血清,冻存于-80℃冰箱待检。检测IMN患者血清抗PLA2R1抗体。1.21肾组织PLA2R1抗原的检测材料：兔抗人PLA2R1多克隆抗体(Sigma, HPA012657), FITC标记抗兔IgG二抗(CW 0114),BSA固体粉末(Sigma公司)。石蜡切片：经烤片;脱蜡；1：20蛋白酶K消化30min；PBS冲洗；5%BSA室温下封闭(勿冲洗)；加一抗(兔抗人PLA2R1多克隆抗体),37℃孵育1.5小时；PBS冲洗3次,甩干后加二抗(鼠抗兔IgG CWIBO);孵育1小时左右,PBS冲洗3次,封片；-20℃避光保存。荧光显微镜下观察,奥林巴斯激光扫描共聚焦显微镜下拍摄。根据荧光强度划分为阴性、±、+、++、+++、++++。阴性对照：对每种疾病均使用PBS替代一抗做对照,只有加PBS阴性并且加一抗阳性者,才判断为阳性。1.22间接免疫荧光法检测IMN患者血清抗PLA2R1抗体遵照欧盟检测试剂盒Phospholipase A2 receptor 1 (PLA2R1) IgG(FA1254-1005-50 IgG)试剂说明书进行样本稀释、加样、温育、冲洗、加荧光二抗、温育、冲洗、封片、荧光显微镜(激发光：488nm)下观看(详细步骤见第一章材料及方法)。1.3收集临床资料收集患者肾活检时年龄、性别、实验室检查(包括血肌酐、血清白蛋白、24小时尿蛋白定量)。根据患者肾脏组织光镜及电镜病理结果,对41例IMN进行病理分期(Ⅰ-Ⅴ期)。2血清中IgA/C3比值在IgA肾病诊断预测中的价值及其与IgA肾病临床及病理联系2.1 研究对象收集南方医科大学第三附属医院2009年12月至2015年2月肾活检诊断为IgA肾病患者66例,其他肾小球疾病患者111例(其中特发性膜性肾病40例,微小病变性肾病33例,非IgA沉积的系膜增生27例和局灶节段性肾小球硬化症11例)和健康对照者40例。并且排除下列：(1)肿瘤、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、过敏性紫癜等继发性IgA肾病；(2)光镜下肾小球数目较少(小于8个肾小球)；(3)肾活检时eGFR<10 ml/min/1.73 m2。IgA肾病诊断根据免疫荧光结果,在肾小球系膜区以IgA和补体C3沉积为主,伴或者不伴IgG和IgM沉积。本研究所纳入病例均未长期使用免疫抑制剂或(和)糖皮质激素治疗。健康对照组参与者尿常规检查均未见尿蛋白,均无高血压、糖尿病、慢性肾炎等病史。2.2临床指标我们收集患者肾活检时年龄、性别、收缩压、舒张压、血尿酸、血肌酐、血红蛋白(Hb)、血清白蛋白(AIb)、血尿素氮(BUN)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)、24小时尿蛋白定量。eGFR使用MDRD公式计算,eGFR=[175×(Scr)-1.234×(Age)-0.179×(if female,0.79)]。血清IgA、补体C3使用CRM470调整后的标准化免疫比浊法检测。2.3病理分级所有肾活检穿刺标本均行光镜、免疫荧光和电镜检查。对IgA肾病进行病理分级(包括Lee氏及牛津分级)。肾活检病理的诊断及分级经两位病理医生独立诊断,有争议的诊断经所有作者参与病理讨论后决定。结果1.成人特发性膜性肾病患者肾组织PLA2R1抗原及血清抗PLA2R1抗体的检测1.1 根据病理类型比较患者的一般资料IMN组、继发性膜性肾病组及其他肾炎组患者在年龄、性别、24小时尿蛋白定量、血清白蛋白、血肌酐间差异有统计学意义(P<0.05)。表明病理类型不同对肾脏的损伤程度有影响,并且肾脏病不同病理类型的发病年龄及性别也不一致。1.2 IMN肾组织PLA2R1抗原阳性与患者阴性一般资料对比IMN患者PLA2R1抗原阳性者与患者PLA2R1抗原阴性者在年龄、性别、血清白蛋白、血肌酐及24小时尿蛋白定量之间差异无统计学意义(P>0.05)。1.3 IMN及继发性膜性肾病肾组织PLA2R1抗原的阳性率在41例特发性膜性肾病中,35例患者肾组织发现PLA2R1抗原的沉积；PLA2R1沿肾小球毛细血管袢呈细颗粒状沉积。其中6例特发性膜性肾病患者肾组织中并未发现PLA2R1抗原的沉积。在继发性膜性肾病(V型狼疮肾炎及乙型肝炎病毒相关性膜性肾病)和其他肾炎对照组患者肾组织中均未发现PLA2R1抗原的沉积。1.4 IMN患者肾组织PLA2R1抗原与血清抗PLA2R1抗体阳性率比较在41例IMN患者血清中,30例抗PLA2R1抗体阳性(阳性率为73.17%)。肾组织及血清均发现PLA2R1者27例,有8例肾组织PLA2R1抗原阳性但血清抗PLA2R1抗体阴性,3例肾组织PLA2R1抗原阴性血清抗PLA2R1抗体阳性,3例两者均阴性。两种检测方法之间差异无统计学意义(P=0.276)。2.血清中IgA/C3比值在IgA肾病诊断预测中的价值及其与IgA肾病临床及病理联系2.1 IgA肾病、其他肾小球疾病和健康对照组基本特征比较IgA肾病、其他肾小球疾病对照组和健康对照组年龄分别为37.42±12.07岁、43.49±16.16岁、46.33±15.01岁。与其他肾小球疾病对照组比较,IgA肾病组患者有较低补体C3、低补体IgM水平和高血清IgG。与健康对照组比较,IgA肾病患者有较高的血肌酐、低eGFR、高血清尿素氮、较高的尿蛋白、高血尿酸。与其他肾小球疾病患者及健康对照组对比,IgA肾病患者有较高的血清IgA(IgA肾病vs其他肾小球疾病,P<0.001;IgA肾病vs健康对照组,P<0.001)及血清IgA/C3比值(IgA肾病vs其他肾小球疾病,P<0.001;IgA肾病vs健康对照组,P<0.001)。ROC曲线示：血清IgA/C3比值在区分IgA肾病与非IgA肾病的敏感性及特异性分别为78.79%和65.6%,曲线下面积是0.776(高于血清IgA),其截断点是2.23。2.2在IgA肾病中血清IgA/C3比值>2.23组和血清IgA/C3比值<2.23组临床资料的差异我们将IgA肾病患者根据截断点2.23分为血清IgA/C3比值<2.23和血清IgA/C3比值>2.23组。与血清IgA/C3比值<2.23组相比,血清IgA/C3比值>2.23组相对年轻、较低的胆固醇、较低的甘油三酯。IgA/C3比值<2.23组24小时尿蛋白定量高于血清IgA/C3比值>2.23组(P=0.016)。血清IgA/C3比值<2.23组,24小时尿蛋白大于等于1g的比率多(P=0.031)。两组间性别、血红蛋白、血清白蛋白、血尿素氮、血尿酸、eGFR、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血清IgM、血清IgG、收缩压、舒张压、Lee分级、内皮细胞增生、系膜增生、肾小球节段硬化、肾小管萎缩/间质纤维化≥25%等指标差异无显著意义。2.3 IgA肾病患者的MEST积分与临床资料的联系根据牛津分级计算MEST积分,并将IgA肾病分为积分≥3组与积分<3组。与积分<3组相比,积分≥3组者有较高的尿素氮、较高的血肌酐、较低的eGFR、较高的24小时尿蛋白和较高的24小时尿蛋白≥1g率。两组在年龄、性别、血红蛋白、血清白蛋白、血清IgA、IgA/C3比值、血清IgG以及Lee分级IV-V(%)的比率间均无显著差异。结论1.在成人IMN患者肾组织中PLA2R1抗原阳性率为85.37%,血清抗PLA2R1抗体阳性率73.17%。肾组织PLA2R1抗原与血清抗PLA2R1抗体阳性率差异无统计学意义。并且肾组织PLA2R1抗原阳性与抗原阴性患者在临床表现上无统计学差异。2.IgA肾病患者血清IgA/C3比值较其他肾小球疾病组和健康对照组明显升高。血清IgA/C3比值在预测IgA肾病中,其ROC曲线下面积为0.776(高于血清IgA)。IgA/C3比值升高与IgA肾病病理损伤程度无明显相关性。在未开展肾活检的医院及不接受肾活检检查的患者,血清IgA/C3比值在IgA肾病诊断中可起一定辅助作用。