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家蚕(Bombyx mori)微粒子病作为传统养蚕业上一种既古老而又具毁灭性的传染性疫病,其致病病原为家蚕微粒子孢子(Nosema bombycis,简称N.b)。
本研究从家蚕等昆虫微孢子虫核糖体16S rRNA、ITS、β-tubulin三个基因着手,经引物设计、PCR扩增、克隆、测序,并用ClustalX、Mega及Bioedit等多种生物信息学软件,系统的研究了不同来源微孢子虫的系统发育关系,探讨了昆虫微孢子虫种内和种间分子变异和物种多样性的原因,希望能为蚕业生产上查明微粒子病流行发生的病原来源,系统控制家蚕微粒子病的发生等提供一定的理论参考。本论文的研究结果如下:
(1) 通过对不同来源家蚕病原微孢子虫16S rRNA基因的克隆测序和生物信息学软件的分析,本试验分别获得了在桑尺蠖中繁殖了24代的家蚕微粒子孢子浙江株(简称25Nbfl)、家蚕病原微孢子虫浙江小孢子及家蚕微粒子孢子浙江株、山东株、重庆株、湖北株、土耳其株等7株(种)不同来源的家蚕病原微孢子虫16S rDNA部分序列,经系统发育分析,这7株(种)不同来源的家蚕病原微孢子虫都归为典型的典型的Nosemabombycis种树支,并推定引起家蚕微粒子病的病原微孢子虫主要是由一群以典型种Nosema bombycis为代表而组成的种复合体(complex)。
(2)介于核糖体LSU rRNA和SSU rRNA基因之间的一对引物ILSUF/S33R对7株(种)不同来源的家蚕病原微孢子虫的模板DNA均进行了有效的PCR扩增和克隆测序,经序列比对分析,分别获得179bp-186bp左右的ITS全序列,说明7株(种)不同来源的家蚕病原微孢子虫的核糖体基因排列顺序均为LSU-ITS-SSU。进一步的分析认为ITS基因区段不适合作为家蚕微粒子孢子Nosema bombycis种内分类的依据。
(3)根据β-tubulin基因保守区段设计的一对引物207F/1048R可以有效地扩增出8株(种)不同来源的家蚕病原微孢子虫的β-tubulin基因中842bp左右的片段。经过距离矩阵分析后发现8株不同来源的家蚕病原微孢子虫之间以及与GenBank上的典型N,bombycis对照株之间的β-tubulin基因序列相似性都达到了96%以上,在系统发育树中都且都落在微粒子属Nosema树支上,β-tubulin基因序列的系统发育分析结果也表明家蚕微粒子孢子N.bombycis是一个种复合体(complex)。
(4) 3株分别来自小菜蛾Plutella xylostella,斜纹夜蛾Prodenia litura Fabricius和柞蚕Antheraea pernyi的昆虫微孢子虫β-微管蛋白基因的部分序列系统发育分析发现,它们与家蚕微粒子孢子N. bombycis相似性高达95%以上,进而为推断家蚕微粒子病病原与野外环境中的昆虫微孢子虫存在交叉感染提供了分子证据。
(5)分别对来自菜粉蝶Pieris rapae、桑尺蠖Hemerophila atrilineta的微孢子虫经转家蚕寄主4代后的微孢子虫进行了分子变异和系统发育分析,结果显示四代微孢子虫之间的分子变异度逐渐增大,与典型种N.bombycis的关系趋于密切,既说明了菜粉蝶和桑尺蠖来源的微孢子虫是一个混合类群,也表明微孢子虫在转寄主繁殖过程中,微孢子虫和寄主之间有一个相互选择的过程。