立体选择性环形节杆菌菊酸乙酯酯酶基因的异源表达

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本文利用大肠杆菌表达系统,酵母表面展示表达系统,枯草芽孢杆菌表达系统分别表达了菊酸乙酯酯酶。从表达结果来看,大肠杆菌的表达量很高,但大部分是包涵体,可溶性蛋白量比较少,酵母表面展示效果不理想,而枯草芽孢杆菌蛋白表达较好而且分泌性好,可溶性蛋白量较多。   在用大肠杆菌表达菊酸乙酯酯酶时,分别将其插入到Novagen公司的pET-26b(+)载体,AmershamPharmaciaBiotech公司的pKK223-3载体。其中插入到pET-26b(+)的基因表达量很高,但包涵体很多。而插入到pKK223-3中的基因表达量较低,于是我们按照大肠杆菌表达偏好修改了酯酶基因核糖体结合位点和起始密码子之间的序列,但是蛋白表达活性未见明显改观。   利用EBY100S.cerevisiae展示表达酯酶,未检测到明显的活性,可能是共表达有困难,或是与AGA2形成的融合蛋白不易被带到细胞表面。   枯草芽孢杆菌的表达载体有pSBPTQ,pMA5Z2和pBE2。前两个载体是直接插入酯酶基因,后一个是构建了一个表达核然后插入到pBE2中去。其中插入到pSBPTQ中的基因表达活性较高,但离理想目标还较远,且质粒稳定性较差。插入到pMA5Z2中的基因,根据枯草芽孢杆菌基因中密码子的使用偏爱性,把酯酶基因前10个氨基酸的密码子改为枯草芽孢杆菌最偏好密码子,获得了较理想的表达。
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