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流感病毒可造成严重呼吸系统疾病,具有多宿主性,且遗传物质易突变、易发生重组,适应性强,容易在动物与人之间、人与人之间传播而引起大流行,增加了防控的难度,严重威胁人类健康。中医药防治呼吸系统疾历史悠久,且具有较为完善的理论体系和用药经验。中药肿节风及其提取物,具有抗菌抗病毒作用,可以控制呼吸道感染,缓解患者的临床症状。然而,肿节风有效化合物活性成分及其抗流感作用机制尚不清楚。基于此,本研究对肿节风中14个主要单体成分进行抗流感病毒药效初筛,发现单体成分刺五加苷B1具有高抗病毒活性。进一步选择刺五加苷B1(刺木骨苷B1)为目标单体,通过系统研究发现刺五加苷B1可以通过调控宿主细胞POLR2A表达进而影响流感病毒的增殖,产生抗流感病毒作用,并进一步揭示了其作用机制,为临床用药提供科学依据。第一部分 肿节风主要单体成分抗流感病毒药效研究目的:1.从14个肿节风主要单体成分中筛选出抗流感病毒活性单体,确定后续研究目标单体。2.研究并确定目标单体抑制流感病毒复制的药效模式、作用时相及关键环节等具体药效机制。方法:1.首先对肿节风中14个主要单体成分进行药效初筛,这些单体分别为落新妇苷、新落新妇苷、异秦皮啶、刺五加苷B1、原儿茶酸、咖啡酸、迷迭香酸、金粟兰内酯E、5-0-咖啡酰莽草酸、草珊瑚宝酯、白蜡树苷、七叶亭、秦皮素和蒿属香豆精。采用药物细胞毒性试验(MTT法),检测各单体成分对MDCK细胞(Madin Darby Canine Kidney,狗肾传代细胞系)的半数有毒浓度(TC50),以确定后续实验给药浓度;采用细胞病变效应抑制试验(CPE),检测各单体成分在MDCK细胞模型中对甲型流感病毒A/PR/8/34株的抑制作用,并用Reed-Mench法计算半抑制浓度(IC50)及选择指数SI(SI=TC50/IC50),评估单体抗病毒效果,筛选最优抗流感病毒作用的目标单体,并进行目标单体的制备。2.采用CPE法,检测目标单体对A/Aichi/68,H3N2等亚型流感病毒的抑制作用,进行抗流感病毒谱筛查;采用预防、治疗和直接作用的三个药效作用模式试验,明确目标单体是直接作用于甲型流感病毒A/PR/8/34株本身,还是通过调节宿主细胞来发挥抗流感病毒作用。采用药物作用时相实验和免疫荧光试验,检测目标单体在甲型流感病毒A/PR/8/34株单个复制周期中的作用时相和环节:在甲型流感病毒A/PR/8/34株感染的MDCK细胞上,取流感病毒感染-2h、Oh、2h、4h、6h和8h的六个时间点,给予刺五加苷B1干预24h后进行病毒滴度和免疫荧光检测。3.利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技术,检测刺五加苷B1对流感病毒8个基因片段mRNA表达水平的调控作用。实验分组:甲型流感病毒A/PR/8/34株感染的A549细胞(人非小细胞肺癌细胞系)为病毒感染模型组,流感病毒感染后给予不同剂量刺五加苷B1(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)处理为刺五加苷B1干预组,非病毒感染A549细胞加入刺五加苷B1(100μg/mL)为刺五加苷B1对照组,各实验组给予相应干预24h,收集细胞并提取RNA进行检测。利用脂质体转染技术将荧光素酶标记的流感病毒聚合酶(RNP)相关基因,转染到293T细胞(人肾上皮细胞系)24h后收集细胞上清液。使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒,检测各组荧光素酶活性,观察刺五加苷B1对流感病毒聚合酶的影响。采用实时荧光定量PCR技术,检测各组TNF、IL27、IL1B、NFκ B1、IL-6、CXCL8、CCL-2和IFNG等细胞炎症因子mRNA的表达水平的差异。结果:1.MTT实验结果显示:肿节风14种主要单体成分落新妇苷、新落新妇苷、异秦皮啶、刺五加苷B1、原儿茶酸、咖啡酸、迷迭香酸、金粟兰内酯E、5-0-咖啡酰莽草酸、草珊瑚宝酯、白蜡树苷、七叶亭、秦皮素和蒿属香豆精,作用于MDCK细胞的体外半数毒性浓度(TC50)分别为:0.455mg/mL、0.783mg/mL、0.252mg/mL、4.127mg/mL、0.196mg/mL、0.56mg/mL、0.126mg/mL、2.004mg/mL、0.128mg/mL、>2.300mg/mL、>1mg/mL、>0.015mg/mL、>0.063mg/mL 和>0.25mg/mL,本研究将以此浓度为最大给药浓度进行后续实验。CPE实验结果表明:落新妇苷和刺五加苷B1具有抗流感病毒活性,其IC50分别为0.455mg/mL和4.127mg/mL,SI指数分别为1.74和11.79,其中落新妇苷为低效,刺五加苷B1为高效低毒,抗病毒活性较强;其他12个单体SI指数小于1,无抗病毒效果。因此,选择刺五加苷B1为后续研究的目标单体。刺五加苷B1的制备及结构鉴定:提取后续实验所需的刺五加苷B1样品后,鉴定其分子量为384,分子式为C17H2409,结构类型为香豆素糖苷。2.刺五加苷B1抗流感病毒谱筛选结果显示:在A/Guangzhou/GIRD07/09(H1N1)、A/Aihi/68(H3N2)、A/Duck/Guangdong/2009,(H6N2)、A/Duck/Guangdong/1994(H7N3)和 A/Chicken/Guangdong/1996(H9N2)等流感病毒株中,刺五加苷B1对A/Guangzhou/GIRD07/09,H1N1、A/Aichi/68,H3N2 流感病毒株具有抑制作用,其 IC50分别为0.064mg/mL、0.125mg/mL,SI指数分别为3.91、2;刺五加苷B1对其他亚型流感病毒没有抑制效果,SI指数小于1。药效作用模式试验结果显示:在治疗模式中,刺五加苷B1对甲型流感病毒A/PR/8/34株有抑制作用,IC50为0.04mg/mL,SI指数为3.625;在预防和直接模式下,刺五加苷B1对甲型流感病毒A/PR/8/34株没有抑制作用,SI指数<1。结果证明,刺五加苷B1对流感病毒粒子本身没有作用,是通过调控宿主细胞来达到抗流感病毒效果。因此,进一步探索刺五加苷B1抗流感病毒药效机制后,将研究它在抗流感病毒中对宿主细胞的调控机制。药物作用时相实验结果表明:与病毒感染模型组相比,病毒复制的早期阶段(0-6 h)加入刺五加苷B1(100μg/mL),病毒滴度显著降低(P<0.05);在病毒感染(-2h或者8h)加入刺五加苷B1(100μg/mL),病毒滴度没有变化(P>0.05)。结果提示,刺五加苷B1主要在流感病毒复制早期起作用。免疫荧光试验结果显示:依次在病毒感染Oh、2h、4h、6h、8h加入刺五加苷B1(100μg/mL),病毒合成的NP蛋白明显减少,但是NP蛋白并没有被限制在细胞核内,在细胞质中仍能观察到NP蛋白;而在病毒感染-2h加入刺五加苷B1(100μg/mL),病毒合成的NP蛋白没有变化,也没有被限制在细胞核内。3.实时荧光定量PCR结果显示:与病毒感染模型组相比,刺五加苷B1(100μg/mL)能够降低病毒基因PB1、PB2、PA、HA、NA、NP和NS mRNA的表达(P<0.05);对病毒基因M mRNA的表达无影响(P>0.05)。流感病毒RNA聚合酶(RNP)活性抑制试验结果表明:与RNP对照组相比,刺五加苷B1(200μg/mL)对流感病毒RNA聚合酶(RNP)具有抑制作用(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果表明:与病毒感染模型组相比,刺五加苷B1(100μg/mL)能显著降低流感病毒诱导的宿主细胞炎症因子TNF、IL27、IL1B、NFκ B1、IL-6、CXCL8、CCL-2 和 IFNG mRNA 的表达(P<0.05)。结论:成功筛选到具有抗病毒活性的目标单体:刺五加苷B1。首次证明,刺五加苷B1主要在流感病毒复制早期起作用,影响流感病毒NP蛋白表达,降低病毒基因表达,抑制流感病毒RNA聚合酶(RNP)活性和流感病毒诱导的宿主细胞炎症因子表达。第二部分 刺五加苷B1在抗流感病毒活性中诱导的宿主细胞基因差异表达研究目的:1.在抗流感病毒作用中,刺五加苷B1诱导宿主细胞基因差异表达情况。2.多步骤验证刺五加苷B1诱导的宿主细胞差异表达基因,筛选潜在作用靶点。方法:1.RNA高通量测序及分析:以A549细胞为空白细胞组(A549),甲型流感病毒A/PR/8/34株感染A549细胞为病毒感染模型细胞组(PR8),病毒感染后加入刺五加苷B1(100μg/mL)为刺五加苷B1干预细胞组(PR8+eleu),分别给予相应干预24h后,收集细胞,提取RNA进行高通量测序;得到测序数据后,采用R语言,对各实验组之间编码RNA(mRNA)和非编码RNA(ncRNA)差异表达水平进行分析,并结合数据库进行功能富集和聚类分析。采用的数据库包括:基因本体论(GO,Gene Ontology)和京都基因与基因组百科全书(KEGG,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)。2.分析PR8+eleu/PR8之间以及PR8/A549之间的显著差异表达mRNAs/ncRNAs,得到两组间相同的显著差异表达mRNAs/ncRNAs并进行功能富集,筛选与流感病毒感染相关的mRNAs/ncRNAs用于下一步验证。采用实时荧光定量PCR技术对所筛选基因进行检测,得到mRNA表达有显著差异且与RNA高通量测序结果一致的基因;采用ChemDraw ultra 8.0和SYBYL-X2.1.1软件,进行分子对接模拟试验,分析上述基因空间构像之间的相互作用,进一步缩小差异表达基因范围。结果:1.RNA高通量测序中差异表达的mRNAs分析结果表明:在PR8+eleu/PR8之间,有 1871 个显著差异表达 mRNAs(Fold change>2,Pvalue<0.05),其中 958 个上调,913个下调,其中有846个mRNAs与PR8/A549之间显著差异表达mRNAs相同;对上述差异表达mRNAs进行基因功能富集发现上述基因涉及各种类型的N-聚糖生物合成、趋化因子信号传导途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用和RNA聚合酶等通路。RNA高通量测序中差异表达的ncRNAs分析结果表明:PR8+eleu/PR8之间,有8个具有显著差异表达的ncRNAs(Fold change>2,Pvalue<0.05),上调的有5个,下调的有3个,其中只有NEAT1与PR8/A549之间显著差异表达ncRNAs相同;基因功能富集结果显示,上述显著差异表达ncRNAs涉及氧化磷酸化、甲型流感、同种异体移植物排斥、自身免疫性甲状腺疾病、I型糖尿病、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路。2.筛选显著差异表达mRNAs/ncRNAs:通过基因功能富集初步筛选与各种类型N-聚糖生物合成、趋化因子信号传导途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路密切相关的46个差异表达mRNAs,包含RNA高通量测序结果中下调最为显著的基因POLR2A(DNA-directed RNA polymerase Ⅱ subunit RPB1,DNA 定向 RNA 聚合酶Ⅱ亚单位),加上显著差异表达ncRNA(NEAT1)共47个显著差异表达mRNAs/ncRNAs,对其进行实时荧光定量PCR验证。实时荧光定量PCR结果显示:与病毒感染模型细胞组相比,刺五加苷B1(100μg/mL)干预细胞组中,上述初步筛选的47个差异表达mRNAs/ncRNAs中只有POLR2A、ALG1、ALG9和IL1RAP的表达被下调(P<0.05),且与RNA高通量测序结果一致,其它所筛选基因表达没有统计学差异(P>0.05)。分子对接结果显示:与宿主基因POLR2A、ALG1、ALG9和IL1RAP进行结构匹配度分数评估中,刺五加苷B1与POLR2A的对接分数为9.0133,排名第一。结论:在抗流感病毒作用中,刺五加苷B1调控宿主细胞多个基因的表达,涉及各种类型N-聚糖生物合成、趋化因子信号传导途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用和RNA聚合酶等通路。其中POLR2A可能为刺五加苷B1调控宿主细胞进而发挥抗流感病毒作用的靶点基因。第三部分 刺五加苷B1对宿主细胞POLR2A基因调控作用机制研究目的:1.验证POLR2A在刺五加苷B1抗流感病毒作用中的关键调控作用。2.初步探究刺五加苷B1对POLR2A的调控机制。方法:1.POLR2A基因过表达/敲除稳定细胞模型的构建及验证:构建携带POLR2A基因的慢病毒颗粒后感染MDCK细胞,通过嘌呤毒素筛选表达POLR2A基因单克隆细胞,并进行细胞扩大培养,构建得到POLR2A过表达细胞模型;采用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR-Cas9)技术,利用Cas9质粒转染MDCK细胞,得到POLR2A基因敲除细胞模型。收集上述构建模型细胞样品,进行蛋白印迹试验,检测POLR2A蛋白表达情况以确认模型是否成功构建。绿色荧光流感病毒的构建及验证:构建标记有绿色荧光蛋白(GFP)的非结构蛋白(NS)重组质粒后,与携带有PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M片段的7个质粒,用脂质体共转染到293T细胞中,得到重组绿色荧光流感病毒,利用细胞和鸡胚进行病毒滴度扩增。通过荧光显微镜观察、病毒血凝实验和透射电镜观察,确认绿色荧光流感病毒构建成功。POLR2A在刺五加苷B1抗流感病毒中关键调控作用的验证:用绿色荧光流感病毒,感染POLR2A基因过表达/敲除稳定细胞模型,确认流感病毒可以在此细胞模型上进行复制后,荧光显微镜下观察不同实验组(病毒感染模型组和病毒感染后刺五加苷B1100μg/mL干预组)NS基因上携带的GFP表达差异;采用细胞病变效应抑制试验,检测刺五加苷B1在POLR2A过表达/敲除稳定细胞模型中,对甲型流感病毒A/PR/8/34株的抑制效果。2.采用启动子活性抑制试验,检测刺五加苷B1对POLR2A启动子活性的影响:首先构建有荧光素酶标签的POLR2A启动子稳定细胞株,进行实验分组:甲型流感病毒A/PR/8/34株感染的A549细胞(人非小细胞肺癌细胞系)为病毒感染模型组,流感病毒感染后给予不同剂量刺五加苷B1(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)处理为刺五加苷B1干预组,非病毒感染A549细胞加入刺五加苷B1(100μg/mL)为刺五加苷B1对照组。按照分组给予相应干预24h后,用荧光素酶检测试剂盒检测各组荧光素酶的表达情况。采用亚硫酸氢钠测序法检测甲型流感病毒A/PR/8/34株感染A549细胞后,刺五加苷B1干预引起的POLR2A CpG岛各位点的甲基化情况。采用蛋白印迹试验,检测各组POLR2A蛋白的表达情况。结果:1.蛋白质印迹试验结果显示:POLR2A过表达细胞模型中,POLR2A蛋白的表达水平高于正常MDCK细胞组(P<0.05),证明POLR2A过表达细胞模型成功构建;POLR2A基因敲除细胞模型中,POLR2A蛋白表达量与正常MDCK细胞相比无显著差异(P>0.05)。因此,选择POLR2A过表达细胞模型用于后续研究。绿色荧光流感病毒拯救结果:荧光显微镜下观察,绿色荧光流感病毒感染MDCK细胞后,能够表达绿色荧光蛋白;病毒血凝实验结果确认其有血凝活性;电镜观察到拯救的流感病毒颗粒,表明绿色荧光流感病毒拯救成功。荧光显微镜下观察显示:在POLR2A过表达细胞模型中,刺五加苷B1不能抑制绿色荧光流感病毒的复制,与病毒感染模型组的荧光表达情况相比无显著差异。CPE法结果显示:在POLR2A过表达细胞模型中,刺五加苷B1对甲型流感病毒A/PR/8/34株没有抑制作用,SI指数<1。2.启动子活性检测结果表明:与病毒感染模型组相比,刺五加苷B1在100μg/mL剂量下,抑制POLR2A启动子活性(P<0.05),但是在25μg/mL和50μg/mL剂量下,没有抑制效果(P>0.05)。亚硫酸氢盐测序(BSP)结果显示:与病毒感染模型组比较,病毒感染后刺五加苷B1(100μg/mL)干预组中POLR2A在-222-72 bp区间CpG甲基化水平比例增加(P<0.05),而在-606-268 bp、-183-476 bp区间甲基化水平没有变化(P>0.05)。蛋白质印迹试验结果显示,与病毒感染模型组比较,病毒感染后刺五加苷B1不同剂量(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)干预组中POLR2A蛋白的表达无显著差异(P>0.05)。结论:刺五加苷B1可能通过影响POLR2A启动子的活性和CpG甲基化水平,来调控POLR2A基因的表达,进而发挥抗流感病毒作用。