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目的:狼疮性肾炎(Lupus nephritis,LN)是系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)常见并发症之一,发病率很高而治愈率较低,长期重度蛋白尿是LN患者主要临床表现之一,也是预后不良的标志,足细胞作为滤过膜的重要组成成分,其细胞骨架维护系统的失调与蛋白尿形成密切相关,而中间丝nestin被证实与足细胞骨架修复密切相关,但机制不明,探明足细胞骨架系统自我保护机制是抑制足细胞损伤,缓解蛋白尿形成的重要途径。因此本实验拟以永生化的小鼠足细胞系为研究对象,以LN患者置换血浆为刺激物,通过检测nestin和nephrin蛋白的表达水平以及线粒体自噬水平并探讨三者之间的关系,揭示nestin在LN足细胞损伤中的保护作用。方法:1.检测LN置换血浆对足细胞nestin蛋白的表达水平:以小鼠足细胞为研究对象,LN置换血浆为刺激物,western blot技术检测足细胞nestin蛋白的表达。2.检测LN置换血浆对足细胞nephrin蛋白的表达水平:以小鼠足细胞为研究对象,LN置换血浆为刺激物,western blot技术检测足细胞nephrin蛋白的表达。3.探讨抑制nestin的表达是否加重LN置换血浆所诱导的nephrin蛋白的表达下调:以小鼠足细胞为研究对象,LN置换血浆为刺激物,通过shRNA技术敲低足细胞nestin蛋白的表达,western blot技术检测足细胞nephrin蛋白的表达。4.检测LN置换血浆对足细胞线粒体自噬水平的影响:以小鼠足细胞为研究对象,LN置换血浆为刺激物,western blot技术检测足细胞PINK1、LC3II/I和P62蛋白的表达,JC-1技术检测线粒体膜电位。5.探讨抑制nestin的表达能否阻断LN置换血浆所诱导的线粒体自噬水平的上调:以小鼠足细胞为研究对象,LN置换血浆为刺激物,通过shRNA技术敲低足细胞nestin蛋白的表达,western blot技术和免疫细胞荧光技术检测足细胞PINK1蛋白的表达。6.探讨抑制足细胞自噬活性是否加重LN置换血浆所诱导的nephrin蛋白的表达下调:以小鼠足细胞为研究对象,LN置换血浆为刺激物,通过3-MA抑制足细胞自噬水平,western blot技术检测足细胞nephrin蛋白的表达。结果:1.LN置换血浆引起足细胞nestin蛋白的一过性升高Western blot结果显示:与对照组相比,LN置换血浆刺激足细胞24 h后nestin蛋白表达升高,48 h下降。2.LN置换血浆引起足细胞nephrin蛋白的一过性升高Western blot结果显示:与对照组相比,LN置换血浆刺激足细胞12 h后nephrin蛋白表达水平明显降低,而与LN置换血浆刺激12 h组相比,LN置换血浆刺激24 h后足细胞nephrin蛋白表达升高,48 h时表达水平降低。3.抑制nestin的表达可逆转由LN置换血浆所引起足细胞neprhin蛋白的一过性升高Western blot结果显示:与LN置换血浆刺激组相比,shnestin+LN置换血浆刺激组nephrin表达水平明显降低。4.LN置换血浆引起足细胞线粒体自噬相关蛋白的一过性升高和线粒体损伤的减轻Western blot结果显示:与对照组相比,LN置换血浆刺激足细胞24 h后PINK1、LC3II/I蛋白表达一过性上调,P62蛋白表达一过性下降;JC-1检测结果显示:与对照组相比,在LN置换血浆刺激12 h后,足细胞内线粒体红色与绿色荧光比值明显降低,在LN置换血浆刺激24 h后其比值有所回复,48 h又重新降低。5.抑制nestin的表达可逆转由LN置换血浆所引起足细胞线粒体自噬相关蛋白的一过性升高Western blot结果显示:与LN置换血浆刺激组相比,shnestin+LN置换血浆刺激组足细胞PINK1表达明显降低;细胞荧光结果显示:shnestin+LN置换血浆刺激组足细胞的PINK1蛋白的表达水平较单纯LN置换血浆刺激组明显减低。6.抑制足细胞自噬活性可逆转由LN置换血浆所引起足细胞nephrin蛋白的一过性升高Western blot结果显示:与LN置换血浆刺激组相比,3-MA+LN置换血浆刺激组足细胞nephrin蛋白表达明显降低。结论:1.Nestin可一过性上调LN足细胞裂孔膜蛋白nephrin的表达。2.Nestin对LN足细胞nephrin的上调作用可能是通过上调线粒体自噬水平实现的。