论文部分内容阅读
肺癌作为所有肿瘤中发病率和死亡率最高的癌症，导致全球大约27％的癌症患者死亡。肺癌的复发率很高，5年生存率仅为17.4％左右，肿瘤分期较高的肺癌5年生存率甚至只有2％。近年来，科研工作者对肺癌的发病机制及其治疗进行了大量的研究，但是对于提升肺癌患者生存期效果甚微，因此对于肺癌进行更深入的研究仍非常有必要。 蛋白质翻译后修饰作为维持细胞自身稳态的一种重要调节方式，主要包括乙酰化、甲基化、糖基化、羟基化、磷酸化和泛素化等。其中泛素化作为一类作用方式复杂且作用结果多样的蛋白质翻译后修饰方式，在蛋白质的降解和功能调节中起着十分重要的作用，几乎参与了细胞增殖、凋亡、分化、基因表达、信号传递等一切生命活动的调控。泛素化通过调控不同底物的稳定性与活性，影响肿瘤的发生和发展。其中E3连接酶是泛素化过程中底物特异性的决定者，被视为癌症发生的重要调节因子，特别是含HECT结构域的连接酶，已然成为研究、开发新药物的新靶标。 HUWE1(HECT,UBA and WWE domain containing1,E3ubiquitin protein ligase，又名MMLE、Ib772、LASU1、UREB1、ARF-BP1等)是一种含HECT结构域的E3连接酶，其底物有N-MYC、C-MYC、MIZ-1、BCL-1、P53、H1.3等。HUWE1通过调节其底物的稳定性，控制着细胞内大量与肿瘤发生密切相关的生物学过程，例如DNA损伤修复、细胞增殖、凋亡、分化以及细胞内稳态等。但是HUWE1是原癌基因还是抑癌基因目前仍存在很大争议。 本研究利用免疫组化以及Western blot分析发现，癌组织的HUWE1蛋白表达水平显著高于癌旁组织。到目前为止，HUWE1过表达对肺癌的发生发展的具体作用尚不清楚，因此我们构建了四环素诱导敲降HUWE1的慢病毒载体并感染A549细胞，发现敲降HUWE1后A549细胞的增殖以及克隆形成能力降低。为了验证HUWE1对A549细胞体内成瘤能力的影响，我们将感染了敲降HUWE1病毒的A549细胞接种于免疫缺陷小鼠皮下，成瘤后利用四环素诱导敲降HUWE1，结果表明肿瘤生长速度显著变慢。取移植瘤石蜡切片染色观察，发现随着HUWE1的敲降，Ki67阳性率降低，Cleaved Caspase3表达升高。在机制研究中，通过对敲降HUWE1的A549细胞进行RNA-seq分析发现，变化的信号通路中与肿瘤相关的主要集中在P53信号通路，P53信号通路中变化的基因中与血管形成相关的主要是SERPINE1、CD82以及与细胞周期相关的是CDKN1A。我们通过Western blot发现在A549细胞中敲降HUWE1后P53和P21表达显著上调，同时对移植瘤的分析发现敲降HUWE1后，血管形成相关蛋白VEGF、CD31和Tie2的表达量下调。这些证据证明敲降HUWE1主要通过P53的累积来抑制细胞增殖，通过抑制血管形成来抑制肿瘤的增长，从而抑制肺癌的发生和发展。