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目的:探讨体外培养牛角膜内皮细胞的最佳方法，并研究内皮素-1(ET-1)对其增殖和移行的影响及氯离子通道-3(chloridechannel3，CLC-3)在其中的作用。
方法:采用2种培养方法和4种培养基体外培养牛角膜内皮细胞。通过损伤模型检测细胞移行。采用免疫组化染色法、MTT法和流式细胞仪检测PCNA表达、细胞增殖和细胞周期变化。免疫荧光测定CLC-3蛋白的表达部位。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹(Westernblot)方法检测CLC-3mRNA和蛋白的表达。采用反义核酸技术，观察CLC-3基因在ET-1对体外培养牛角膜内皮细胞影响中的作用。
结果:显微分离后弹力膜及内皮细胞层联合延迟消化培养法，体外培养牛角膜内皮细胞成功率高。采用DMEM/F12(1：1)培养基，细胞贴壁、生长、形态和活性最好。细胞在转录和翻译水平均有内源性CLC-3基因表达，表达产物定位于细胞膜和部分细胞浆。ET-1呈剂量相关性的促进培养的牛角膜内皮细胞增殖和移行，联合应用重组人表皮生长因子(rhEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对细胞增殖有协同作用。ET-1剂量依赖性增加CLC-3mRNA及蛋白的表达，氯通道阻断剂5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoicacid，NPPB)和CLC-3反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，AS-ODN)浓度依赖性抑制ET-1促进细胞增殖、CLC-3mRNA及蛋白表达的作用，并使细胞周期停滞于G1期，阻止细胞进入增殖期。
结论:ET-1通过开放氯通道，增加CLC-3mRNA和蛋白的表达，促进培养的牛角膜内皮细胞增殖和移行。它和rhEGF、bFGF联合应用时有协同作用。CLC-3AS-ODN和NPPB阻断CLC-3氯通道，抑制ET-1促进细胞增殖的作用，使细胞周期停滞于G1期。ET-1作为一种生长因子，有望成为治疗角膜内皮细胞损伤的新型药物之一。