高通量测序筛选肝癌细胞中受Dicer调节的非编码RNA

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目的:  Dicer是核糖核酸酶Ⅲ家族成员之一,在RNAi(RNA interference,RNAi)途径中起着关键作用,是microRNA(miRNA)和small interfering RNA(siRNA)生物合成过程中的关键酶。非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是细胞中广泛存在的、对基因表达起调控作用、但自身不翻译产生蛋白的RNA分子。ncRNA包括siRNA,miRNA和长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等等。  近年来研究表明,ncRNA在肿瘤发生发展过程中起重要作用,在肝脏中敲除Dicer导致肝癌发生。因此我们推测受Dicer调节的ncRNA可能在肝癌发生发展过程中起重要作用。本论文试图研究在肝癌细胞系中Dicer能够调节哪些ncRNA的表达,并用生物信息学方法对这些受Dicer调节的ncRNA进行初步功能注释,为后续深入研究奠定基础。  方法:  用RNA干扰技术在HepG2.2.15细胞中抑制Dicer的表达,然后用Illumina测序对Dicer knockdown细胞和对照细胞进行转录组和小RNA测序,并运用生物信息学方法对测序结果进行分析。在对原始下机数据进行质量控制过滤后,将两种测序数据分别进行基因组比对、基因差异表达、miRNA表达以及靶基因预测等分析,再综合两类测序的数据和分析结果,从已知的miRNA及其预测靶基因的表达、来源于Rfam的lncRNA表达等方面研究并分析受Dicer调节的相关ncRNA的表达情况,并进行初步功能分析。  结果:  整合两种高通量测序数据的分析结果,我们发现168个成熟体miRNA在样本间存在显著性表达差异,并对这些miRNA进行了靶基因预测。同时,在转录组水平获得表达差异显著的4,019个mRNA记录,功能注释结果显示差异表达基因在细胞表面受体信号转导通路、G蛋白耦合受体信号通路等多个方面呈现高度富集。将通过小RNA测序得到的差异miRNA的预测靶基因与这4,019个mRNA记录进行交叉重叠比较,得到2,284个记录(>56%),即它们不仅是样本之间表达有显著差异的miRNA的靶基因,且在RNA水平表达差异显著。对来源于Rfam-lncRNA的小RNA(sRNA)表达分析结果显示,来源于7SL RNA的小RNA在样本间的表达差异显著。而在重复序列分析中,重复序列的表达总量在两个测序数据中均不存在明显的样本间差异。对NATs表达分析的结果表明,来源于NATs的小RNA总量在抑制Dicer的样品中降低,但在转录组水平表达并未显示出相应上升的趋势。  结论:  在对Dicer表达受抑制的样本和对照组样本中的RNA测序数据进行相关分析和比较后,我们首先发现多个参考基因和miRNA在样本间存在差异表达,其中超过一半的差异表达基因是这些miRNA的预测靶基因,因此这些基因在样本间的表达变化可能是由miRNA的改变引起的,进一步的功能注释结果显示受Dicer调节的基因参与多个生物途径。此外,Rfam-lncRNA数据库中,7SL RNA受Dicer调节;抑制Dicer对重复序列表达水平无明显影响;而抑制Dicer影响来源于NATs的小RNA表达,但不影响NATs的转录水平。
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