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研究背景失巢凋亡是内皮及上皮细胞脱离细胞外基质发生细胞凋亡的一种特殊的死亡形式。其对于防止这些细胞于异处生长具有重要意义。在肿瘤转移过程中,转移的肿瘤细胞要多次脱离细胞外基质,因此失巢凋亡与肿瘤转移具有密切的关系,阐明其分子机制对于肿瘤及其转移的防治具有重要意义。目前,有关失巢凋亡的作用机制还不太清楚,有研究表明与死亡受体细胞凋亡信号转导途径具有一定的联系。死亡受体(death receptor, DR)5是死亡受体家族的重要成员,DR5是一良好的抗肿瘤作用靶点,其活化可转导细胞凋亡信号,在抗肿瘤方面具有重要的应用前景。有研究结果提示,DR5可能参与细胞的失巢凋亡,但有关确切作用有待证实,作用机制不清楚。研究目的明确DR5在食管癌细胞失巢凋亡中的作用,并阐明DR5在食管癌细胞失巢凋亡中的作用机制。研究方法将去粘附化的食管癌细胞悬浮培养。通过RNA干扰技术建立DR5基因沉默的食管癌细胞系。免疫细胞化学技术分析食管癌DR5表达及分布;利用流式细胞术检测食管癌细胞表面DR5的表达、细胞凋亡、ROS及Ca2+。定量PCR技术检测DR5的基因表达。利用免疫印迹技术分析食管癌细胞的DR5表达、细胞色素C释放及capase活化;利用免疫共沉淀分析DISC;并利用乙酰半胱氨酸探讨ROS在食管癌细胞表面DR5的表达及细胞凋亡中的作用。研究结果1、建立了DR5基因沉默的食管癌细胞系;2、去粘附化过程中发生食管癌细胞凋亡,并具有时间依赖性;去粘附显著增强食管癌细胞对DR5的抗体诱导细胞凋亡的敏感性。3、去粘附化过程中,食管癌细胞内ROS水平、Ca2+浓度以及细胞膜DR5表达水平均升高,并具有时间依赖性,而且DR5基因表达增强;DR5基因沉默的食管癌细胞凋亡率、细胞内ROS水平、DR5表达较低。乙酰半胱氨酸对食管癌细胞DR5的表达、细胞凋亡、细胞内ROS均有抑制作用。4、酶免疫细胞化学及免疫荧光显示,在粘附铺展细胞中,DR5主要分布在细胞质中,在细胞核没有DR5分布,DR5以均质状主要分布在细胞核膜周围;而在未处理去粘附化细胞中,DR5也主要分布在细胞质,但以颗粒状靠近细胞膜分布。5、免疫印迹结果显示,失巢凋亡过程中有caspase 8/ caspase 9/ caspase 3的激活以及tBid的活化,并有细胞色素C的释放。6、免疫共沉淀结果显示,失巢凋亡过程中的形成了DISC,出现DR5及caspase 8。结论1、DR5参与了食管癌细胞的失巢凋亡过程并起主要作用。2、去粘附化主要通过ROS增强DR5表达及转运,并导致DR5寡聚化发生自我活化,从而激活死亡受体细胞凋亡信号转导途径诱导失巢凋亡的发生。