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丁烯酸是一种重要的化工原料，主要应用于合成杀虫剂、树脂、涂料、增塑剂、杀菌剂和粘合剂等。其在化妆品、医药、造纸、纺织和建筑等行业具有非常重要的应用价值。目前，工业上生产丁烯酸的方法主要为传统化学合成，需要在高温、高压、催化剂等复杂反应条件下进行，而且生产原料依赖化石炼制产品。以化石燃料等不可再生资源为基础的化工炼制是一个高能耗、高污染的过程。近年来，随着经济的发展，丁烯酸供不应求，丁烯酸的市场价格也逐渐攀升。当前，我国正处于建设资源节约型和环境友好型国民经济体系时期，为了减少传统化学方法生产丁烯酸的过程中对资源和环境的压力，寻找合成丁烯酸的生物新途径成为当务之急。国外仅有Dellomonaco等利用大肠杆菌脂肪酸降解途径合成丁烯酸的报道，而且丁烯酸只是作为副产物，其产量仅为171mg/L。然而，还没有关于利用大肠杆菌脂肪酸合成途径合成丁烯酸的研究报道。工程菌大肠杆菌具有遗传背景清楚，易于工程调控，可高密度发酵等诸多优点，已经成为微生物催化生物合成的理想受体菌。目前，工程菌大肠杆菌已成功用于脂肪酸代谢衍生物和生物能源物质的生产，像生物乙醇、异丁醇、乳酸、丁二醇等。本论文针对上述微生物合成途径中丁烯酸产量偏低的问题，以野生型大肠杆菌为出发菌株，首次构建了利用大肠杆菌脂肪酸合成途径合成丁烯酸的基因工程菌。 在大肠杆菌脂肪酸合成途径中，丁烯酰-ACP（酰基载体蛋白）是其脂肪酸合成碳链延伸过程中的中间产物。丁烯酰-ACP在特异性硫酯酶的作用下，可以水解为游离的丁烯酸，理论上大肠杆菌具有生产丁烯酸的潜力。通过文献调研得知多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）硫酯酶对C4脂酰底物具有较高的活性，在大肠杆菌中过量表达该硫酯酶，合成了丁烯酸。进一步敲除脂肪酸降解途径中的第一个关键酶基因(fadD），以阻断丁烯酸的降解，提高丁烯酸的积累量。采用特异性抑制剂三氯生抑制FabI（烯酰-ACP还原酶）的活性，以积累更多的丁烯酰-ACP前体，从而提高丁烯酸的产量。进一步通过发酵条件控制，优化了发酵基质及工艺参数，显著提高了丁烯酸的合成水平。具体研究如下: 1.人工合成多形拟杆菌（B.thetaiotaomicron）硫酯酶基因(bTE)，构建了bTE的不同表达载体，分别转入不同大肠杆菌中，构建了bTE表达菌株XP-1，XP-3，XP-5，XP-7，XP-9和XP-11。经SDS-PAGE分析和MALDI-TOF鉴定，重组多形拟杆菌硫酯酶蛋白得到正确表达，其分子量为28.7 kDa。 2.利用HPLC方法检测bTE表达菌株的发酵液，结果显示不同bTE表达菌株都合成了丁烯酸（0.07-11.4 mg/L）;进一步通过GC-MS方法对BSTFA衍生化的菌株XP-1的发酵液样品进行了鉴定，结果表明该丁烯酸合成途径正确。 3.利用大肠杆菌BW25113 Keio单基因突变体文库和P1噬菌体转导技术进一步构建了敲除fadD基因的bTE表达菌株XP-2，XP-4，XP-6，XP-8，XP-10和XP-12，阻断丁烯酸的降解途径。敲除fadD基因后，bTE表达菌株丁烯酸产量提高，其中，菌株XP-2丁烯酸的积累量最高，为18.7 mg/L，比菌株XP-1(11.4 mg/L)提高了1.6倍。 4.IPTG诱导bTE表达的同时添加1 mg/L的三氯生，抑制FabI的表达量，菌株XP-2丁烯酸的产量为57.1 mg/L，比不添加三氯生提高了3倍。 5.对菌株XP-2的培养条件进行了优化，确定菌株XP-2的最佳诱导浓度为80μmol/L IPTG，最佳初始pH条件为7.0，最佳碳源及浓度为葡萄糖（5 g/L），最佳氮源及浓度为胰蛋白胨(5 g/L)，最佳接种量为6％，最适培养温度为37℃。最终丁烯酸积累量达到179.3 mg/L。 6.对菌株XP-2进行了丁烯酸耐受研究:菌株XP-2在15-20 g/L的丁烯酸浓度下，还可以保持相对良好的生长状态。 7.最后，对菌株XP-2进行了多次补料发酵研究:5-L发酵罐中培养48 h，丁烯酸的终产量为4.1 g/L，生产率为86.3 mg/L/h，糖酸转化率为3.2％。