拟南芥热激因子AtHSF1对番茄的遗传转化和转基因植物分子特征分析

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拟南芥热激因子AtHSF1是重要的耐逆境因子,以往研究工作发现AtHSF1过量表达的拟南芥转基因植株表现出对热及酸、碱、H2O2的耐受性,然而AtHSF1是否能改良农作物的耐逆境能力、过量表达植株的分子特征如何,目前不清楚。针对上述问题,一方面,本论文运用农杆菌介导的方法用AtHSF1过量表达载体转化番茄,建立番茄遗传转化体系,获得了AtHSF1过量表达转基因番茄植株。另一方面,采用实时荧光定量PCR的方法检测了番茄和拟南芥转基因植株的热激因子AtHSF1与热激蛋白HSP70和HSP18.2在mRNA转录水平的表达特征,为理解AtHSF1耐逆境机理提供理论依据。   本研究的主要结果如下:   (1)以番茄下胚轴为外植体,用6-BA、ZT分别与IAA配成激素组合,最终确立了一个有效的分化培养基配方:MSBV+1 mg/l ZT+0.1 mg/l IAA+3%蔗糖+0.8%琼脂粉,PHS.8。   (2)研究了若干因素对农杆菌介导的番茄遗传转化的影响,建立了一个较为理想的番茄遗传转化体系:下胚轴在分化培养基上预培养2 d;侵染时间为20 mm;共培养时间为2 d;草胺磷PPT对下胚轴的筛选压为10 mg/l;当芽长到1 cm以上时,将抗性芽切下,转入MSBV+0.05 mg/l IBA的生根培养基中诱导生根。   (3)提取番茄基因组DNA,以拟南芥转基因植株为阳性对照,未转化的番茄植株为阴性对照,用PCR方法检测再生植株是否为转基因植株。结果表明:检测的5个株系中有3个株系扩增出明显的目的条带,与阳性对照扩增出的条带位置相同,说明外源热激因子AtHSF1基因已整合到番茄基因组中。从番茄中提取总RNA,经实时荧光定量PCR,检测转基因番茄LeHSP70在mRNA水平的相对表达量。发现在非逆境条件下,转基因植株的LeHSP70 mRNA表达量高于野生型植株,高温逆境诱导LeHSP70进一步表达,但野生型植株的表达高于转基因植株。   (4)从拟南芥中提取总RNA,经实时荧光定量PCR,检测AtHSF1过量表达转基因拟南芥热激因子AtHSF1与热激蛋白HSP70和HSP18.2在mRNA水平的相对表达量。发现转基因植株的AtHSF1的mRNA相对表达量显著高于野生型植株,在非逆境条件下AtHSF1与HSP的mRNA相对表达量呈极显著的正相关关系;经过高温(加热)逆境处理后AtHSF1与HSP的mRNA相对表达量呈显著的负相关关系。
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