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伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种急性传染病,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。PRV作为疱疹病毒科的成员,能在感染的宿主体内建立终身潜伏感染,一旦在应激状态下,PRV可能会被重新激活,造成再次感染,因此PRV的潜伏感染已成为预防和根除伪狂犬病的重大障碍。尽管在疱疹病毒潜伏感染方面已有较多研究,然而用自然宿主猪作为模型研究PRV潜伏再激活的机制方面报道甚少。本课题利用自然宿主猪建立了PRV感染的潜伏再激活模型,在此模型基础上,研究了PRV潜伏再激活过程中病毒典型基因的转录时序。检测部分细胞因子在PRV潜伏再激活过程中的变化。利用iTRAQ技术筛选潜伏再激活过程中发生磷酸化的宿主蛋白,应用生物信息学分析差异表达的磷酸化蛋白,进一步验证差异表达蛋白对PRV复制的影响。关于本课题具体研究如下:1成功在自然宿主猪中构建PRV感染的潜伏再激活模型选择PRV抗体阴性仔猪进行试验,每周采集眼、鼻拭子进行病毒滴度测定,结果显示,攻毒21 d后,眼、鼻拭子未检出病毒粒子,表明PRV感染的仔猪进入潜伏感染期。同时,每周采集仔猪全血,分离血清,进行ELISA和抗体中和试验。结果表明当PRV处于潜伏感染期时,PRV中和抗体持续存在,ELISA结果进一步说明攻毒有效。攻毒8周后,用地塞米松处理进行再激活,处理3 h后,将仔猪全部扑杀,收集每组的三叉神经节(TG)浸泡福尔马林,用于免疫组化试验。结果显示,PRV在经过地塞米松处理后被激活。同时,荧光定量PCR(q PCR)检测TG中病毒基因组拷贝数的结果进一步表明,PRV在地塞米松处理后在仔猪体内由潜伏感染状态转变为再激活状态。综上所述,本文在自然宿主体内构建的PRV潜伏再激活模型是成功的。2潜伏再激活过程中典型病毒基因表达紊乱为进一步确定潜伏再激活过程PRV基因在转录水平的变化。我们选择了典型的病毒基因IE180、EP0、VP16和g B基因进行q PCR试验。结果显示,潜伏组检测到LLT基因,该基因由外显子1、2和内含子组成。外显子1和2分别重叠EP0和IE180基因。再激活组检测到IE180、EP0、LLT-内含子和VP16,未检测到g B基因。这表明在天然宿主细胞中,PRV的再激活未遵循上皮细胞感染IE-E-L模式。3潜伏再激活过程中细胞因子浓度的变化为评价PRV潜伏再激活过程细胞因子的变化,我们采用Luminex x MAP方法,选择IL-1beta、IL-6、IL-8、IFN-alpha和TNF-alpha细胞因子进行检测。结果显示,IL-6在潜伏再激活过程中浓度显著升高,表明IL-6参与了这一过程;IL-1beta和IFN-alpha浓度在对照组和潜伏组中差异不显著,再激活组中降低;IL-8和TNF-alpha浓度在潜伏组中明显高于对照组和再激活组。4潜伏再激活过程中TG中磷酸化蛋白鉴定为进一步了解PRV潜伏再激活过程中宿主蛋白磷酸化对PRV潜伏再激活过程的影响,采用iTRAQ定量检测对照组和试验组中TG的磷酸化蛋白。共检测到磷酸化蛋白质1876个,磷酸化肽段4661个。按照表达变化倍数1.2倍(上调Ratio>1.2,下调Ratio<0.83)以上,且P<0.05标准筛选的差异表达磷酸化蛋白,在潜伏再激活过程中差异表达的磷酸化蛋白质中上调的125个,下调的117个。5分泌型磷酸化蛋白(sPP1)对PRV增殖的影响根据GO功能和KEGG分析,预测出sPP1可能在PRV潜伏再激活过程有一定作用,用si RNA干扰sPP1基因和超表达sPP1基因后,检测sPP1对PRV增殖的影响。结果显示si RNA干扰sPP1基因后能抑制PRV增殖,超表达sPP1基因后能促进PRV增殖。本课题利用自然宿主猪建立了PRV感染的潜伏再激活模型,发现PRV潜伏再激活过程中病毒基因的转录并未遵循立即早期基因-早期基因-晚期基因规律。通过检测部分细胞因子,发现IL-6参与PRV潜伏再激活调节,IL-8和TNF-alpha参与PRV潜伏感染调节。利用iTRAQ技术结合生物信息学分析预测到潜伏再激活过程中差异表达的磷酸化蛋白质中上调的125个,下调的117个。根据预测分析进一步验证分泌型磷酸化蛋白(sPP1)在潜伏再激活过程中参与PRV复制过程,这些结果将为进一步探究PRV潜伏再激活的感染机制提供理论依据。