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脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)主要是由禾谷镰刀菌、粉红镰刀菌等镰刀菌产生的次级代谢产物,广泛存在于大麦、小麦、玉米等谷物及其制品中,严重危害人类及动物的健康。DON具有急性和慢性毒性,可引起厌食、呕吐、腹泻和发烧等症状,同时还具有细胞毒性、免疫毒性等多种毒性作用。鉴于DON的巨大危害,国内外研究人员已经建立起了多种检测方法；其中,免疫分析法由于其简便、快速、特异性好、适合高通量检测等特点而被广泛应用。免疫学分析法基于抗原-抗体的特异性结合,为提高灵敏度,最直接的方法是制备高亲和力的天然或人工抗体；但该方法较为困难,且容易遇到瓶颈。另一种方法为改造抗原；针对小分子检测,改造抗原进行异源性分析往往能提高免疫分析方法的灵敏度。传统的抗原改造是通过人工合成半抗原的结构类似物,但该方法具有一定的盲目性,过程较复杂,且人工合成过程会对操作人员和环境带来危害。本研究以DON单克隆抗体为靶分子,从驼源天然纳米抗体库中淘选与DON单抗特异结合的纳米抗体,以该纳米抗体作为DON抗原模拟物,替代传统的人工抗原,不仅减少了人工抗原合成过程中DON的污染,而且建立了DON的异源性免疫分析方法提高了检测灵敏度。采用分子模拟技术和丙氨酸扫描技术,构建并验证了纳米抗体与DON抗体的结合模型,从分子水平上揭示了纳米抗体模拟DON抗原的作用机制。继而采用定点饱和突变技术,对纳米抗体进行改造,获得灵敏度提高的突变子,并以其建立免疫学检测方法。主要研究结果如下：1.基于纳米抗体的DON抗原模拟物的淘选采用“1轮酸洗脱+3轮竞争洗脱”的组合洗脱方式,经过4轮淘选,获得了两个能与DON标品特异性竞争结合DON单抗的噬菌体克隆,分别命名为P-28和P-31。分别建立了基于P-28和P-31的Phage-ELISA标准曲线,IC50分别为78.89±1.77 ng/mL和68.18±1.15ng/mL,线性范围分别为21.24-316.52 ng/mL和16.36-262.05 ng/mL。2.纳米抗体的表达及其在免疫检测中的应用将P-28和P-31的编码基因克隆至pET-25b(+)表达载体,并转入E.coli Rosetta(DE3)表达菌,经IPTG诱导表达并纯化,获得纳米抗体蛋白N-28和N-31。以N-28和N-31分别建立了ELISA标准曲线,IC50分别为8.77±0.41 ng/mL和19.97 ±0.84 ng/mL,灵敏度比基于DON-BSA建立的标准曲线(IC5o为163.69±2.68ng/mL)分别提高了18倍和8倍。以N-28作为检测抗原建立了检测谷物中DON的间接竞争ELISA,用该方法对谷物样品进行检测,同时与商业化ELISA试剂盒进行对比,结果显示两种方法的相关性系数R2=0.997。3.纳米抗体N-28模拟DON抗原分子机制的研究采用分子模拟技术构建了N-28/DON与anti-DON ScFv的结合模型,比较两个模型发现N-28与DON对接于ScFv的同一位点,N-28的CDR3区氨基酸Thr102-Ser106能够模拟DON与ScFv相互结合。随后采用丙氨酸扫描技术验证了分子模拟预测的对接模型。4.纳米抗体N-28的定点改造将N-28的5个关键氨基酸分别进行定点饱和突变,通过Phage-ELISA和测序进行筛选和鉴定,最终得到77个不同的突变子；其中3个突变子(N-28-T102Y、 N-28-V103L和N-28-Y105F)的灵敏度与野生型N-28相比分别提高了3.2、1.5和2.2倍。以N-28-T102Y建立了Phage-ELISA,用该方法对30份实际样品中的DON进行检测,同时与商业化ELISA试剂盒进行对比,结果显示两种方法的相关性良好(R2=0.981)。