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研究背景：鞘脂是真核细胞膜的主要成分,能代谢产生多种重要的信号分子。在鞘脂代谢物中,神经酰胺(Cer)和鞘氨醇磷酸(S1P)与癌症的发生和发展密切相关。Cer具有肿瘤抑制作用,能够抑制肿瘤细胞增长、促进细胞凋亡；而S1P则被认为具有促癌作用。细胞内Cer和S1P的动态平衡往往决定着细胞是处于增殖还是凋亡状态。维甲酸类药物是维生素A的结构及功能类似物的总称,这类物质对于调节细胞的增殖、分化和凋亡具有重要作用。维甲酸类药物的作用主要由核内受体维甲酸受体(RAR)和维甲类X受体(RXR)介导,通过激活RAR/RXR二聚体促进含有RXRs或RARs识别元件的靶基因转录而实现。维甲酸受体的表达缺失是癌症发生过程中的常发与重要事件,这可能导致肿瘤对维甲酸类药物产生耐药性。除了促进靶基因转录外,维甲酸受体RXRα还可能进入细胞质发挥重要作用,其中RXRα与孤儿受体TR3以二聚体形式进入胞质,引起细胞凋亡,这被认为是非常重要的促进细胞凋亡途径之一。本课题主要进行以下方面的研究：(1)Cer是否通过RXRα出核机制诱导细胞凋亡?(2)SlP对维甲酸类药物肿瘤抑制作用的影响及产生机制。该项研究的对于深入了解鞘脂类代谢产物影响维甲酸受体胞内定位,功能改变和信号通路的异常传导十分重要,同时其发现的S1P介导肿瘤产生对维甲酸类药物产生耐药性、发现新靶点和设计维甲酸衍生物具有指导意义。实验方法：1.Cer促进RXRα出核的意义以免疫荧光染色法检测人肝癌SMMC-7721和肺癌H460细胞内源性RXRα在Cer作用下的胞内定位变化,以Western blotting法确认细胞中Cer促使RXRα出核现象。以瞬时转染法检测外源性表达的GFP-RXRα在Cer作用下能否由核内迁移进入胞质。以荧光素酶报告基因法分析293A细胞中Cer能否拮抗9-cis-RA促进RAR/RXR对含有维甲酸识别元件(RARE)的报告基因转录水平。以MTT法分析Cer抑制SMMC-7721与SMMC-7721/RXRα细胞生长程度的差异。以Western blotting法检测SMMC-7721和H460细胞中不同时间点的RXRa表达量及cleaved PARP表达变化。2.S1P引起肿瘤细胞对维甲酸类药物耐药的机制研究以MTT法检测不同浓度S1P对SMMC-7721和PLC/PRF/5细胞生长的影响,以流式细胞仪检测S1P能否解除全反式维甲酸(ATRA)所致的细胞G1期阻滞作用。以Western blotting法和实时定量PCR法检测S1P对ATRA诱导细胞RARβ表达的影响,以荧光素酶报告基因检测法分析S1P能否拮抗ATRA对含有RARE的报告基因的转录促进作用。以免疫荧光染色和瞬时转染法分析细胞中RXRα和鞘氨醇激酶2(Sphk2)定位的一致性,以免疫共沉淀法检测Sphk2和RXRα能否结合。在HT-29细胞中瞬时转染HA-Sphk2和空载体,以Western blotting法和半定量RT-PCR法检测外源表达的Sphk2(?)能否抑制ATRA和RXR激动剂LGD1069促进RARβ转录和表达的作用,在293A和HT-29细胞中,以荧光素酶报告基因检测法分析Sphk2(?)能否抑制ATRA和9-cis-RA对含有RARE的报告基因的转录促进作用。以半定量RT-PCR法检测蛋白酶体抑制剂MG132能否解除S1P抑制ATRA促进RARβ转录的作用。以Western blotting法检测RXRa在LGD1069和ATRA存在时的蛋白降解能否被S1P增强,以及S1P促进对RARβ在ATRA存在时的修饰和降解。实验结果：1.Cer能够促进RXRa由细胞核迁移进入细胞质在含有0.5%血清的培养基中,以10μM的Cer处理12小时后,H460和SMMC-7721细胞均出现凋亡特征,同时RXRa出核进入细胞质中。Western blotting实验确认了Cer引起SMMC-7721细胞的RXRa出核现象。在SMMC-7721细胞瞬时转染GFP-RXRα, Cer处理10h后,荧光显微镜发现RXRα已经进入细胞质中。2.Cer引起细胞凋亡的作用并不依赖于RXRα出核诱导凋亡这一途径荧光素酶报告基因检测实验证明,Cer不影响9-cis-RA促进RXR/RAR对靶基因的转录。在建立的SMMC-7721/RXRα稳定表达细胞中RXRα表达量明显增高,而MTT结果显示Cer对SMMC-7721/RXRα和SMMC-7721细胞生长抑制作用差异并不显著。在Cer诱导SMMC-7721细胞凋亡的过程中,3h时cleaved PARP明显增多,至12h达高峰；而RXRα表达量在9h下降,第12h下降14.2%,这两个时间点正是RXRα出核最明显之处。Cer所致的RXRα降解在H460细胞中尤为明显。3.S1P拮抗ATRA和LGD1069抑制细胞生长作用MTT结果显示：与10μMATRA单独作用比较,合用0.01或0.1μM S1P后,HT-29细胞增殖水平分别增加了15.1%和26.2%,H460细胞增殖增加了14.0%和15.2%。与10μM LGD1069单独作用相比,合用1gM的S1P时,A549细胞数增加33.5%,而HCT116细胞增加29.8%。进一步分析发现,ATRA(5μM)能够引起HT-29细胞G1期阻滞,合用S1P(0.1gM),则能解除ATRA引起的细胞G1阻滞。4.S1P拮抗ATRA诱导RARβ表达作用Western blotting结果显示：ATRA(1μM)能使HT-29和SMMC一7721细胞RARβ表达量明显增加,S1P则能抑制ATRA对RARβ表达的诱导作用。Real-time PCR结果显示：S1P的上述拮抗作用具有时间依赖性。荧光素酶报告基因实验发现：S1P浓度为0.001,0.01和0.1μM时,RARE转录活性与ATRA单独作用相比分别下降7.8,19.4和37.3%。5.Sphk2与RXRα能结合并抑制ATRA和LGD1069对RXR/RAR的激活与内源性表达的Sphk2和RXRα相同,在HT-29细胞中转染的HA-Sphk2和GFP-RXRα均位于核内,而在TPA刺激下均进入胞质中。以免疫共沉淀实验发现Sphk2与RXRα能够结合,而Sphk1则不能与之结合。RT-PCR和Western blotting结果表明：转染了Sphk2的细胞,ATRA和LGD1069诱导RARp的转录和表达水平明显减少。荧光素酶报告基因实验证明：随着Sphk2剂量增加,ATRA和9-cis-RA促进报告基因转录的作用随之下降。6.S1P拮抗ATRA诱导RARβ表达作用与蛋白酶体降解途径有关以半定量RT-PCR结果发现,与ATRA单独作用相比,S1P和ATRA联合作用时HT-29细胞RARβ的mRNA表达量下降了41.8%；而当ATRA, SIP和MG132联合作用时,仅比ATRA单独作用降低了7.7%。7.S1P促进维甲酸受体配体依赖性降解Western blotting结果证明：LGD1069单独作用时RXRα产生了配体依赖性降解,当S1P与LGD1069联合作用时,RXRα表达量进一步下降47.3%。ATRA能够诱导RXRa的降解作用,但ATRA与S1P合用时RXRα的量比ATRA单独作用时反而增加了91.7%,说明RARβ表达水平的降低可能导致RXRα不能被ATRA诱导降解。当ATRA和MG132合用时,在RARβ上方出现了新条带,合用S1P后条带加深。用抗乙酰化赖氨酸抗体检测发现AT(?)A和MG132合用时也出现了一条新条带,当ATRA,MG132和S1P联合作用时条带也加深,初步推测是RARβ发生了乙酰化修饰。实验结论：1.由Cer引起的RXRa出核现象可能并不直接引起凋亡作用,其出核的直接作用可能与Cer诱导细胞凋亡时蛋白的降解作用有关。2.S1P通过增强维甲酸受体的配体依赖性降解作用,进而抑制维甲酸类药物促进靶基因的转录,致肿瘤细胞对维甲酸类药物产生耐药性。3.高表达的Sphk2能抑制维甲酸类药物促进RXR/RAR对靶基因转录的作用。