论文部分内容阅读
抗菌肽是在动物、植物和微生物中广泛存在的一类分子量低、水溶性强、热稳定性好的广谱抗菌活性物质。它是机体受到病原感染后，经过对病原的识别、信号传导进而被激活的一系列免疫效应物中很重要的一类。对抗菌肽的研究有助于加深人们对先天免疫系统作用机制的了解。同时由于抗菌肽的多方面特点，也使得抗菌肽在疾病的预防与治疗、药物的开发、食品的保鲜与储藏以及农业、畜牧业、水产养殖业生产有着巨大的应用前景。
对虾素是一类结构独特的抗菌肽，并在多种对虾中都有发现。目前，将对虾素分为5类，不同的对虾素都表现出对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的抗菌活性。对虾素的研究主要集中在对其表达模式、重组表达和结构与活性研究等方面。本实验室首先从中国对虾中克隆得到两种中国对虾素(Ch-penaeidin-3和5，Chp3、Chp5)。本论文将这两种中国对虾素作了重组表达的研究、性质的研究并制备了多克隆抗血清：
1.CHP3、CHP5在大肠杆菌中的重组表达。成功构建了mchp3-pGEX-4T-1、mchp5-pGEX-4T-1重组质粒，转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21。GST-CHP3、GST-CHP5得到高表达量的诱导表达。用亲和纯化的方法对融合蛋白进行了纯化。凝血酶裂解融合蛋白去除GST，用液体抑制的方法对目的蛋白CHP3、CHP5进行了抑菌活性检测。CHP3表现出一定的抑菌活性而CHP5的抑菌活性不强。
2.用大肠杆菌原核表达纯化得到的融合蛋白GST-CHP3、GST-CHP5免疫家兔，制备了兔抗CHP3和CHP5多克隆抗血清，免疫双扩散检测抗血清滴度最高达到8倍稀释，Westernblot显示兔抗CHP3多克隆抗血清对大肠杆菌表达的GST-CHP3以及酵母分泌表达的CHP3能较好的识别。兔抗CHP3和CHP5多克隆抗血清的制备为进一步研究中国对虾素的表达模式和杀菌机制打下基础。
3.对CHP3进行了毕赤酵母细胞内表达的研究。构建了带有四个表达框的4×mchp3-pAO815的重组质粒，转化毕赤酵母(YeastPichiapastoris)KM71，筛选得到转化菌株并进行了诱导表达，但无法检测CHP3的表达情况。用pGAPα-A载体和pPIC9K载体对CHP5进行了毕赤酵母细胞外分泌表达的研究。构建了CHP5-pGAPα-A和CHP5-pPIC9K重组质粒。转化毕赤酵母KM71，在培养上清中检测有表达产物。用离子交换层析对表达产物进行了纯化。牛津杯法检测到纯化产物对大肠杆菌等有一定的抗菌活性，进一步进行了抗菌谱的测定。结果表明，纯化产物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有一定的抑菌活性，对革兰氏阳性菌的抑菌效果较好。通过对CHP5在毕赤酵母细胞外分泌表达的表达研究为进一步大规模发酵生产以及测定CHP5的结构打下基础。