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第一部分:小鼠颅骨骨溶解模型的建立和褪黑素对骨溶解抑制作用的效果评价目的:探讨褪黑素对磨损颗粒诱导骨溶解的治疗作用。方法:以钛颗粒诱导小鼠颅骨骨溶解模型为研究对象,选60只、7-8周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分成4组:正常对照组,建模组、建模组+低剂量褪黑素组、建模组+高剂量褪黑素组。正常组小鼠不做任何处理,高、低剂量褪黑素给药组是从术后第一天腹腔注射200微升分别含50mg/kg、5mg/kg的褪黑素。模型组给予等量的PBS溶液。术后2周,取颅骨分别行micro-CT(μCT)、组织学染色、和免疫组织化学分析,颅骨培养上清液行酶联免疫吸附试验(ELISA)分析。结果:μCT三维重建可见在模型组有很多骨破坏形成的吸收陷窝,相比之下褪黑素治疗组的陷窝则呈浓度相关性的减少,定量分析结果显示骨密度(BMD)、骨体积/总体积(BV/TV)在褪黑素治疗后都有明显增加。H&E染色显示骨侵蚀及而骨膜厚度则明显降低。TRAP染色显示ROI区域低、高剂量褪黑素治疗组的破骨细胞数目分别是45.81±5.72、14.63±3.91,相比模型组的破骨细胞数(66.40±10.43),有统计学差异。免疫组化证实褪黑素抑制了骨破坏局部IL-1β,IL-6,TNF-α的表达;ELISA结果提示炎症因子IL-1β,IL-6,TNF-α在模型组是182.5±16.73pg/ml,182.76±13.97pg/ml,298.34±24.63pg/ml,而低剂量褪黑素治疗组的炎症因子表达量显著降低(分别是145.76±12.33pg/ml,144.38±14.38pg/ml,167.03±17.06pg/ml)。差异有统计学意义。结论:褪黑素通过抑制磨损颗粒与颅骨界面的炎症反应,并减少局部破骨细胞数目,减轻了磨损颗粒诱导的骨溶解。第二部分:骨髓细胞的培养及褪黑素对破骨分化的抑制作用目的:探讨褪黑素对RANKL诱导破骨细胞活化的影响及其可能的作用机制。方法:培养骨髓来源的巨噬细胞(BMMs),在基础培养基加入不同浓度褪黑素(0,0.25,0.5,1mM)进行干预4小时后,加入M-CSF(30ng/ml)和RANKL(50ng/ml)培养5天,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色用来评价不同浓度褪黑素对破骨前体细胞分化的影响。另外,骨板吸收实验和DAPI染色用来检测破骨细胞的活性和功能在褪黑素治疗后的变化。Western Blot用来检测褪黑素对参与调控破骨细胞活化的相关信号通路关键蛋白表达的影响。结果:BMMs予褪黑素干预5天后的TRAP染色结果可见在RANKL组布满紫红色成熟破骨细胞,而在0.25-1mM褪黑素组发现成熟破骨细胞呈浓度相关性减少,Image J分析结果显示0.25、0.5、1mM褪黑素组TRAP成熟破骨细胞计数分别为330.03±20.12个/cm~2、130.35±21.25个/cm~2、65.33±11.93个/cm~2。与RANKL组(383.33±32.15个/cm~2)比较有统计学差异(p<0.01)。骨板吸收结果显示0.5及1mM褪黑素组吸收面积对比Control组分别下降了47.33%、63.67%(p<0.05)。F-actin环的形态和数量也在褪黑素治疗组呈现不同程度的破坏和减少,同时Western blot结果显示RANKL和Ti颗粒的存在使得p-IκBα、p-P65及c-Fos和NFATc1的表达显著增加,而褪黑素明显抑制上述因子的蛋白水平,而对IKKα、ERK、JNK、P38、AKT1的磷酸化无明显影响。结论:褪黑素有效抑制破骨细胞前体细胞的早期分化,同时抑制了破骨细胞的活性和功能,而这些作用有可能是因为褪黑素抑制了NF-κB通路和其下游蛋白的表达。