【摘 要】
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目的:利用通用引物聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术快速鉴定细菌.方法:根据细菌共有的16SrRNA基因保守区序列设计两对通用引物(P11P-P13P,ER10-ER11),选取几种常
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目的:利用通用引物聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术快速鉴定细菌.方法:根据细菌共有的16SrRNA基因保守区序列设计两对通用引物(P11P-P13P,ER10-ER11),选取几种常见的细菌:标准株-大肠埃希菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923),临床株-肺炎克雷伯菌、甲型副伤寒沙门菌、产气肠杆菌、洛菲不动杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)作为实验菌株,并以白色念珠菌、新型隐球菌作为阴性对照,利用DNA抽提试剂盒提取DNA.不含模板DNA的PCR反应液用DNA酶Ⅰ预处理以去除外源性DNA的污染.以不含模板DNA的PCR反应液作为空白对照,进行PCR扩增,扩增条件:94℃lmin,56℃lmin,72℃30s,扩增30个循环.PCR产物热变性后在8﹪非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,电泳条件:1×TBE,4℃,16mA 4h(电泳槽置于4℃冰箱中),随后凝胶通过银染观察细菌的单链构象多态性.同时用PCR-SSCP技术直接检测13份颅内感染患者的脑脊液中的细菌,并与细菌培养比较.结论:通过PCR-SSCP技术将不同细菌的标准菌株的SSCP图谱存入数据库作为模式图谱,将临床病原菌的SSCP图谱与之比较,可简便、快速、敏感地检测细菌,尤其适用于临床无菌部位如血液、脑脊液的病原菌快速检测.
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