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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第七大常见的癌症,位于因癌症死亡的第三位,每年约650000人死于HCC,且其发病率有逐年增高的趋势。该病多发于东南亚和非洲,其中约有50％以上发生于中国,位居我国癌症死亡率的第二位。HCC的转移是影响其治疗效果和临床预后的最大障碍,是导致HCC高死亡率的主要原因。由于HCC容易早期肝内播散,因此临床上HCC肝外转移相对较少。HCC的转移是一个连续、渐进的多步骤动态过程。近年来,尽管针对HCC的转移进行了大量研究并找到了许多重要分子,但HCC转移的分子机制仍不明确,尚未发现能预测HCC复发转移的分子标志物和有效的分子靶标。
本实验室前期研究发现,Na-K-Cl协同转运蛋白1(bumetanide-sensitivesodium—potassium-chloride cotransporterl,NKCCl)在高转移肝癌细胞株中表达上调,因此可作为潜在的HCC转移标志物进行深层次的功能验证。Na-K-Cl协同转运蛋白是一类膜蛋白,负责转运Na、K、Cl离子进出细胞。它被鉴定出来两个同源异构体:NKCCl和NKCC2。NKCC1存在于多个组织中,NKCC2只存在于肾脏。NKCC1的功能主要是调节细胞离子平衡与细胞体积。
为了进一步研究NKCC1参与HCC转移的分子机制,我们采用RNA干扰、过表达、活性抑制的技术对HCC细胞系中NKCC1的表达量和活性进行研究,考察其是否与HCC转移相关,并探索其参与HCC转移的分子机制。
RNA干扰实验选取具有较高转移能力的HCC细胞株MHCC97H作为细胞模型。首先通过构建针对NKCC1的特异性的shRNA质粒载体,通过转染MHCC97H细胞筛选到特异性抑制NKCC1表达的shRNA,并经G418筛选得到稳定敲低NKCC1的MHCC97H细胞株-shNKCC1细胞株,与此同时也得到阴性对照稳定细胞株-NC细胞株,通过Quantitative Real-time PCR及Westernblot鉴定其NKCC1的表达水平与正常MHCC97H细胞相比显著下降。
过表达实验选取具有较低转移能力的HCC细胞株MHCC97L作为细胞模型。首先将表达NKCC1的载体转染到MHCC97L细胞筛选到特异性高表达NKCC1的质粒载体,经G418筛选得到稳定过表达NKCC1的MHCC97L细胞株-hNKCC1细胞株,同时也得到阴性对照稳定细胞株-NC细胞株,通过Western blot鉴定其NKCC1的表达水平与正常MHCC97L细胞相比显著升高。
活性抑制实验采用活性抑制剂对肝癌细胞中NKCC1的活性进行抑制。通过活性实验检测其活性与未处理的肝癌细胞相比显著下降。
HCC转移过程涉及细胞的增殖、迁移和侵袭等方面的性质,因此本研究从体内体外两个方面对这几个过程进行研究。
首先,在体外通过RNA干扰实验比较shNKCC1和shNKCC1-NC细胞株(pGPU6/GFP/neo载体)的增殖、迁移和侵袭能力,结果显示shNKCC1细胞与shNKCC1-NC细胞相比,其体外增殖、迁移和侵袭能力均显著下降,这说明NKCC1表达量的降低会抑制细胞的转移过程；在体内通过向裸鼠脾脏接种shNKCC1和shNKCC1-NC细胞来观察肿瘤的肝脏转移情况、向裸鼠皮下接种shNKCC1和shNKCC1-NC细胞来观察肿瘤的增殖情况、向裸鼠尾静脉注射shNKCC1和shNKCC1-NC细胞来观察肿瘤的肺转移情况,结果显示shNKCC1组细胞的体内增殖能力、肝转移能力、肺转移能力与shNKCC1-NC组细胞相比明显下降,这表明NKCC1表达量的降低抑制了肝癌细胞的体内增殖、肝转移、肺转移的能力。
其次,在体外通过过表达实验比较hNKCC1、hNKCC1-NC和MHCC97L细胞株(pcDNA载体)的增殖和侵袭能力,结果显示hNKCC1细胞与hNKCC1-NC及MHCC97L细胞相比,其体外增殖、迁移和侵袭能力均显著升高,这说明NKCC1表达量的升高促进了细胞的转移过程；在体内通过向裸鼠皮下接种hNKCC1和hNKCC1-NC细胞、向裸鼠尾静脉接种hNKCC1和hNKCC1-NC细胞来观察肿瘤的体内增殖、转移情况,结果显示hNKCC1组细胞的体内增殖能力、转移能力与hNKCC1-NC组细胞相比明显升高,这表明NKCC1表达量的升高促进了MHCC97L细胞的体内增殖能力和转移能力。
最后,在体外通过活性抑制实验比较其活性抑制剂(BUM)对肝癌细胞株(MHCC97H和Huh7)转移能力的影响。发现抑制NKCC1活性的MHCC97H和Huh7细胞株的体外增殖和侵袭能力均显著下降。说明NKCC1活性的降低会抑制细胞的转移过程。
在确定NKCC1与HCC转移相关的基础上,检测了一些与转移相关的标志物,进一步探索其参与HCC转移的机制。
本课题采用RNA干扰技术建立稳定敲低NKCC1表达水平的MHCC97H细胞株、采用过表达技术建立稳定过表达NKCC1表达水平的MHCC97L细胞株、采用活性抑制剂抑制肝癌细胞中NKCC1的活性,通过体内外实验确证了NKCC1与HCC转移的相关性,并初步探讨了NKCC1参与HCC转移的分子机制。