膜联蛋白A2在糖基化终末产物诱导的内皮细胞骨架重构及迁移中的作用初探

• 作 者: 毕超
• 机 构: 济南大学
• 出 处: 济南大学
• 发表日期: 2012年01期
• 关键词: 膜联蛋白A2 糖基化终末产物 细胞骨架 迁移 磷酸化

目的1、观察糖基化终末产物对人脐静脉内皮细胞骨架重构、迁移能力的影响2、观察膜联蛋白A2对糖基化终末产物培养的人脐静脉内皮细胞骨架重构、迁移能力变化的影响3、观察糖基化终末产物对人脐静脉内皮细胞膜联蛋白A2表达的影响方法第一部分：建立人脐静脉内皮细胞体外培养模型，应用siRNA技术干扰膜联蛋白A2的表达，实验分正常组(葡萄糖浓度为25mmol L^-1的高糖型DMEM)、阴性干扰组（controlsiRNA预干扰HUVEC，继用高糖型DMEM）及阳性干扰组（ANXA2siRNA预干扰HUVEC，继用高糖型DMEM），应用Western Blot验证干扰效果。第二部分：实验进一步分正常组(葡萄糖浓度为25mmol L^-1的高糖型DMEM)、BSA组(高糖型DMEM，另含0.2g L^-1BSA)、AGE-BSA组(高糖型DMEM，另含0.2g L^-1AGE-BSA)、阴性干扰组(control siRNA预干扰HUVEC，继用高糖型DMEM，另含0.2g L^-1AGE-BSA)及阳性干扰组(ANXA2siRNA预干扰HUVEC，继用高糖型DMEM，另含0.2g L^-1AGE-BSA)。应用FITC-鬼笔环肽染色结合荧光显微镜观察各组中细胞骨架排布的变化，划痕法观察各组中细胞迁移能力的变化。第三部分：应用免疫沉淀及Western Blot观察正常组(葡萄糖浓度为25mmol L^-1的高糖型DMEM)、BSA组(高糖型DMEM，另含0.2g L^-1BSA)及AGE-BSA组(高糖型DMEM，另含0.2g L^-1AGE-BSA)中ANXA2及磷酸化ANXA2的表达。应用单因素方差分析LSD法分析上述数据。结果第一部分：Western Blot结果表明转染完成后正常组、阴性干扰组及阳性干扰组ANXA2蛋白的表达量分别为（1.170±0.027）、（1.182±0.037）及（0.676±0.053），前两者之间差异无统计学意义(LSD_{正常,阴性}=-0.013，P_{正常,阴性}=0.713>0.05)，阳性干扰组同前两者相比，ANXA2表达量减少有统计学意义(LSD_{正常,阳性}=0.494，P_{正常,阳性}=0.000<0.05；LSD_{阴性,阳性}=0.506，P_{阴性,阳性}=0.000<0.05)。第二部分：分组处理24h后FITC-鬼笔环肽染色观察正常组、BSA组、AGE-BSA组、阴性干扰组及阳性干扰组细胞骨架，前两者骨架排布无明显差异，应力纤维均匀且稀疏；AGE-BSA组同前两者相比，应力纤维聚集且致密；阴性干扰组同AGE-BSA组相比，骨架排布无明显差异，而阳性干扰组的骨架则回至稀疏均匀排布。分组处理后24h，正常组、BSA组、AGE-BSA组、阴性干扰组及阳性干扰组迁移入划痕内的细胞数分别为（153±12）、（143±16）、（192±8）、（176±6）及（142±14），AGE-BSA组、阴性干扰组同正常组、BSA组及阳性干扰两两相比，有统计学意义增多，余分组间比较均无统计学差异(LSD_{正常, BSA}=10.000，P_{正常, BSA}=0.331>0.05；LSD_{正常, AGE-BSA}=-39.000，P_{正常, AGE-BSA}=0.003<0.05；LSD_{正常,阴性}=-23.000，P_{正常,阴性}=0.041<0.05；LSD_{正常,阳性}=11.667，P_{正常,阳性}=0.261>0.05；LSD_{BSA, AGE-BSA}=-49.000，P_{BSA, AGE-BSA}=0.001<0.05；LSD_BSA,阴性=-33.000，P_BSA,阴性=0.007<0.05；LSD_BSA,阳性=1.667，P_BSA,阳性=0.868>0.05；LSD_{AGE-BSA,阴性}=16.000，P_{AGE-BSA,阴性}=0.133>0.05；LSD_{AGE-BSA,阳性}=50.667，P_{AGE-BSA,阳性}=0.000<0.05；LSD_{阳性,阴性}=34.667，P_{阳性,阴性}=0.005<0.05)。第三部分：免疫沉淀及Western Blot结果表明，分组处理后，正常组、BSA组及AGE-BSA组总ANXA2蛋白的表达量分别为（1.011±0.014）、（0.939±0.089）及（1.064±0.119），三者之间无统计学差异(F_ANXA2=1.596，P=0.278>0.05)。而磷酸化ANXA2蛋白的表达量分别为（0.942±0.057）、（0.945±0.032）及（1.118±0.095），前两者比较亦无统计学差异，而AGE-BSA组同前两者比较，有统计学意义增多(LSD_正常,BSA=-0.002，P_正常,BSA=0.967>0.05；LSD_{正常,AGE-BSA}=-0.176，P_{正常,AGE-BSA}=0.018<0.05；LSD_BSA,AGE-BSA=-0.173，P_BSA,AGE-BSA=0.019<0.05)。结论1、糖基化终末产物可促使人脐静脉内皮细胞骨架重构，细胞迁移能力增强。2、膜联蛋白A2在糖基化终末产物重构细胞骨架，促使细胞迁移过程中发挥作用。3、膜联蛋白A2可能通过酪氨酸磷酸化发挥上述作用。