论文部分内容阅读
快速、准确的检测是防控和净化牛布病和结核病（以下称“牛两病”）的前提，为了减少以扑杀的方式来消除牛两病的流行，加强牛两病疫情监测及防治工作，通过市场提供安全、廉价、敏感、特异的多种牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌重组抗原，本研究拟克隆牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌抗原基因，构建重组原核表达质粒，并建行了重组抗原鉴定，为牛血清中布鲁氏菌抗体和结核杆菌抗体的检测提供有价值的抗原，为我国牛两病的诊断试剂的研发奠定基础。主要完成以下三个方面的研究工作：1、利用PCR技术和基因工程技术，成功克隆了牛布鲁氏菌BCSP31、BP26、Cu-Zn SOD、DnaK、L7/L12、OMP17.3、P39和牛分枝杆菌Ag85B、CFP10、ESAT-6、HBHA、MPB63、MPB70、MPB83共14个抗原基因，并成功构建了这14个抗原基因的重组原核表达质粒。经过测序鉴定，克隆的这14个抗原基因与预期克隆的目的基因在核苷酸序列及氨基酸序列上都具有高度的同源性，达99.3%以上。2、将14个抗原基因的重组原核表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌进行原核表达，然后利用Ni柱亲和层析法、电洗脱法等对表达产物进行纯化。结果得到大部分纯度90%以上、浓度在1.0~2.0mg/mL的重组抗原。3、通过建立的用于鉴定重组抗原抗原性的间接ELISA法，证明了本研究纯化的牛布鲁氏菌rBP26、rDnaK、rOMP17.3和牛分枝杆菌rAg85B、rCFP10、rESAT-6、rHBHA、rMPB70、rMPB83具有良好的抗原性，适于作为候选的诊断抗原，为牛血清中布鲁氏菌抗体和结核杆菌抗体的检测提供有价值的抗原。