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中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis Roem)是石蒜科多年生观赏植物,在春节期间开花,是中国十大传统名花之一,具有很高的经济和观赏价值。由于它是同源三倍体,传统的杂交选育存在极大困难;且它的野生资源匮乏、病虫害严重、生长周期长、生长开花对温度要求高,致使它在越来越激烈的世界花卉产业竞争中面临挑战。因此,本研究应用RT-PCR技术,克隆与中国水仙花发育相关基因NTLEAFY和凝集素相关基因NTA,运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析,并开展了遗传转化的研究,得到以下主要结论:1、NTLEAFY基因全长为1340 bp,含有完整的编码框1137 bp,编码378个氨基酸,编码的氨基酸序列pI和分子量分别为8.00和42 274.65 Da。通过NCBI网站Blast分析,NTLEAFY基因与洋水仙、风信子等不同物种的LFY同源基因的一致性达76%以上;NTLEAFY基因编码蛋白与洋水仙、风信子、拟南芥等LFY同源基因编码的蛋白一致性达57%以上。同源性分析显示,NTLEAFY编码的氨基酸具有转录因子的基本结构,NTLEAFY蛋白与其他物种中LFY蛋白都具有可变区和C-端有较高的保守性。蛋白结构预测表明,中国水仙NTLEAFY蛋白与拟南芥LFY蛋白在结构上非常相似。采用实时荧光定量PCR方法,选用GAPDH作为内参基因,对中国水仙不同组织、花发育的不同时期和不同器官NTLEAFY基因转录水平上的表达量进行检测。结果显示,NTLEAFY基因在生殖器官和营养器官中均有表达,NTLEAFY基因在花蕾表达量很高,其后出现的小花的表达量只为花蕾表达量的1/8;NTLEAFY基因在中国水仙花的雄蕊中的表达量较高,而雌蕊、花被和副冠中的表达量较低,这说明它对中国水仙的营养生长和生殖生长有着一定的调控作用。本研究构建了NTLEAFY基因的植物过表达载体,通过蘸花法转化拟南芥并获得了转基因植株,但是,转基因植株并没有提前开花,且转基因植株矮小,叶片畸形,叶片和顶端花序具备花的形状,且出现了5个花瓣的花。初步表明NTLEAFY基因参与了转基因植株的花期和花型的调控作用。2、本研究采用RT-PCR的方法,从中国水仙花蕾中克隆了凝集素基因NTA,运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析以及对其蛋白结构进行预测。结果表明,得到的NTA基因全长698 bp,包含一个完整的开放阅读框519 bp。该基因编码一个含有172个氨基酸的凝集素前体蛋白,该前体蛋白的等电点和分子量分别为5.84和18 615.19Da。序列比对结果表明中国水仙NTA序列与其他单子叶植物凝集素基因相似性均达82%以上,NTA基因编码的蛋白与其他单子叶植物的凝集素蛋白的同源性达77%以上。蛋白结构预测表明,中国水仙凝集素蛋白与洋水仙凝集素蛋白在结构上非常相似。对该基因编码的蛋白进行分析及蛋白结构模拟可知,该蛋白含有三个特殊的功能结构域和alpha-D-甘露糖结合表面(QXDXNXVXY)。本研究构建了NTA基因的植物过表达载体,通过蘸花法转化拟南芥并获得了转基因植株,转基因植株的花与对照相比,没有明显的区别,茎杆直,侧枝少,且茎明显粗大,叶片宽大,荚果长而大。