恶臭假单胞菌KT2440异源表达植物螯合肽合成酶及其Cd耐受性的研究

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由工农业生产活动排放的重金属对人类和生态环境造成了日益严重的危害,许多重金属聚集在土壤中很难清除。如何解决重金属污染问题尤其是镉污染一直是一项非常紧迫的任务。传统的利用物理和化学方法很多不仅效果不好,花费巨大,有时还会改变土壤自身的物理和化学构造。近来,一种利用植物促生菌(PGPB)和植物协同互作的方法引起了科学工作者的注意,PGPB可以为植物提高重金属的利用度和耐受性,因此可以在重金属污染土壤中促进植物生长,为治理重金属污染问题提供了一种非常经济有效的方法。  本课题以一种植物促生菌恶臭假单胞菌KT2440为研究对象,首先将来源于裂殖酵母中的植物螫合肽合成酶(PCS)通过广宿主表达载体pBBR1MCS-5,成功构建了pBBR1MCS-SpPCS,将其电击转化入KT2440中,得到正确的转化子KT2440-SpPCS。在30℃下经0.6mM IPTG和20μM CdCl2诱导后,利用蛋白电泳技术检测到了目的蛋白的特异性表达,且表达量随着时间的增加而增加。通过检测对照菌和重组菌体内的非蛋白巯基(NPT)含量,结果显示随着重金属离子浓度的提高,表达了SpPCS的工程菌的生长情况好于对照菌株,对照菌和重组菌非蛋白巯基含量都会显著增加,而重组菌的非蛋白巯基的总量显著高于对照菌株。  本文还通过实时荧光定量PCR验证了恶臭假单胞菌中,SpPCS的表达同样受到了微量Cd的诱导,在同样的恶臭假单胞菌重组菌中,相比于未经Cd诱导的SpPCS基因,20μMCdCl2诱导的SpPCS表达量上调了2.26倍;另外,同种质粒在E.coli和P.putida中表达的SpPCS也有差异,在E.coli中的表达量是P.putida的两倍多。  为了验证SpPCS的导入是否会提高宿主菌的重金属耐受能力,本论文分别运用不同浓度的Cd和其它重金属的冲击,结果表明,基因工程菌确实可以提高Cd,Ag和Hg的耐受能力,而对于Pb的效果却并不明显,相反的,SpPCS的导入降低了工程菌对于Cu的耐受能力。并且,我们还通过石墨炉原子吸收仪检测到工程菌可以显著提高对于Cd、Ag、Pb的吸收量,尤其是在经过0.6 mM IPTG诱导6个小时后,细胞中的Cd含量可以达到14.32μmol/g(dry weight)。而与耐受能力相对应的,工程菌对于Cu的吸收量比对照菌株低。  另外,在Cd胁迫的小麦种子萌发实验中,接种了转基因工程菌的小麦种子的萌发情况都要优于其它对照组,尤其是在0.5和1.0 mM的CdCl2生长环境下。表明在Cd环境胁迫的种子萌发中,重组菌合成的植物螯合肽对培养液中的重金属Cd的螯合作用可以一定程度上抵御Cd的毒害作用,显示了植物螯合肽在植物促生菌恶臭假单胞菌KT2440和植物协同修复污染环境中的重金属中的作用价值。
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