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Grb-AST1是从蟋蟀(Gryllus bimaculatus)脑中分离的一种咽侧体静体激素,体外实验显示它强烈抑制昆虫咽侧体合成保幼激素,半衰期显著地比其它Grb-AST长。这个多肽含有9个氨基酸残基,一级结构为N-AQHQYSFGL。蟋蟀AST基因共编码15个AST多肽,Grb-AST1是第8个,其编码序列定名为Grb-ast8。本论文采用三种方法构建Grb-ast8串联体,并将构建后的串联体导入大肠杆菌进行表达分析。 根据Grb-AST1和GKR(AST神经肽之间的连接序列)的编码序列设计合成3对引物。这3对引物分别采用不同的方法进行串联体的构建。第一对引物利用Klenow DNA聚合酶和T4 DNA连接酶进行随机串联;第二对引物使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ和E. coli DNA连接酶,采用缺口补平法进行拼接;第三对引物通过高保真DNA聚合酶(PyrobestTM DNA Polymerase),利用PER“自身模板-引物”法进行构建,从中克隆到一个含有8个Grb-ast8的串联体。 将Grb-ast8串联体基因克隆进大肠杆菌pET22b表达载体,测序表明读码框架正确后,将重组子导入表达宿主菌E. coli BL21进行表达分析。通过菌液浓度(OD600=0.4,0.8)和诱导剂浓度(0.1mM,0.5mM,1.0mM)梯度筛选,得到一个最优诱导浓度组合。表达产物经SDS-PAGE可见重组质粒受体菌比空白质粒受体菌多表达了一种蛋白质,且这个蛋白质的分子量与理论推导值13.86KD一致。 生物活性测试结果表明,Grb-ast8串联体表达产物对菜粉蝶幼虫(Pieris rapae)具有一定的毒害作用。