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对虾养殖水环境内细菌及对虾体内肠道细菌群落在虾池物质循环、虾病害发生与否以及对虾的生长、营养和免疫方面都产生重要作用，因此近年来对虾养殖水域和对虾体内肠道细菌群落结构的研究逐渐受到重视。其中，弧菌是一类对虾养殖系统内常见的，并且与对虾免疫、疾病、生长乃至人类的疾病都密切相关的细菌，其中存在多个致病种或株。长期以来环境细菌(包括弧菌)的微生态研究均是依赖于培养的方法，不仅费时、费力还缺乏准确性。采用分子手段来调查环境中细菌群落的结构及检测某些特定细菌种类的存在均属于分子生态学的范畴。本研究主要采用PCR结合DGGE的分子手段对对虾不同养殖水域和对虾体内肠道细菌群落结构进行了比较研究，并且成功利用PCR结合DGGE来同时检测多个弧菌病原。主要研究内容及结果如下：
⑴比较了7种不同的DNA提取方法从对虾养殖水中提取DNA的产量、纯度以及它们对于对虾养殖水细菌群落结构DGGE分析的影响。同时也比较了不同通用引物对细菌群落DGGE分析结果的影响。结果表明7种DNA提取方法获得了的DNA产量和纯度均不同。从7种DNA提取方法获得的DNA(未稀释)均能用于以968f/1401r为引物的PCR扩增。可以鉴别的DGGE条带数量因为不同的引物对而异，采用同一种方法提取的DNA模板，968f/1401r引物对产生了最多DGGE条带。同时发现不同的DNA提取方法导致不同细菌群落指纹图谱，这表现在DGGE胶中条带的数量和及某些条带的相对亮度不同上。7种DNA提取方法中，方法1产生了最多的条带数量(各37条)，方法2产生最少的条带(分别为28、30条)。利用方法4虽然能获得最高的DNA产量，但产生的DGGE条带数量却少于方法1。不同方法所产生的条带数量多少差异主要表现在相对弱亮度条带的有无上。这些结果说明，为了获得某一特定环境最为广泛的细菌物种多样性，应当对PCR—DGGE的通用引物进行选择。同时，在PCR—DGGE前也应当优化针对某一特定环境的DNA提取方法，那些既能够获得较高DNA产量和较高DNA纯度又能获得最大限度的细菌群落多样性的DNA提取方法应当被选择使用。
⑵应用PCR—DGGE技术研究了凡纳滨对虾河口咸淡水养殖系统内各种环境的夏季微生物群落多样性。同时也运用传统的微生物培养技术对该系统内各种环境的可培养细菌、弧菌及芽孢杆菌(孢子)数量进行了计数。平板培养计数表明：从海湾沿岸水、养殖池水到对虾粪样，可培养细菌和弧菌的数量表现出依次增加的趋势，粪样及肠壁中弧菌的数量高出外界水环境1-4个数量级。相对于外界水环境，粪样中具有很高的芽孢杆菌孢子含量，但是肠壁定植细菌中不存在芽孢杆菌(孢子)。PCR—DGGE及聚类分析结果表明：从海湾沿岸、养殖池、对虾粪便到对虾肠壁，微生物群落(主要是细菌)的多样性由高到低，无论是在哪种环境，群落的优势种都十分明显，且只有2—4种。来自同一环境各样品间的微生物群落组成非常相似，来自不同环境的样品，其微生物群落组成差别较大。聚类图上各簇的排列顺序反映了样品在取样空间分布上的毗邻次序和它们的相似程度。
⑶采用细菌通用引物对968f/1401r扩增细菌(包含极少量其它微生物)16SrRNA基因片段，后进行DGGE分析，对凡纳滨对虾海水养殖系统内各个单元的细菌群落结构进行了比较研究，并对DGGE胶上的部分主要条带进行了测序鉴定。结果表明，沿岸水、沉淀蓄水池水、养殖水具有较高的细菌的多样性，而沉淀蓄水池的入水口、对虾粪样及肠壁定植细菌样以及排水渠污水的微生物多样性程度低。从沿岸水、养殖池水、对虾粪便到对虾肠壁，微生物多样性程度由高到低。无论是在哪种环境，群落的优势种都十分明显，且只有1-9种，它们分别对应于DGGE泳道中的亮条带。三个养殖池水样(Y1、Y2、Y3)的微生物群落结构具有高度的相似性。两个沿岸水样(W1、W2)、两个粪样(F1、F2)、沉淀蓄水池水样(B1、B2)及两个肠壁定植细菌样(G1、G2)也各自具有高度的群落结构相似性。沉淀蓄水池进水口水样(B1)与沉淀蓄水池水样(B2、B3)有明显的差距，同样取自第三条对虾的粪样(F3)及肠壁定植细菌样(G3)与取自第一和第二条虾的粪样(F1、F2)及肠壁定植细菌样(G1、G2)也有明显的“遗传”差距，这种差距反映了它们的微生物群落组成的不同。各样品的排列顺序不能反映出样品在取样空间位置上的毗邻次序和相似程度。与优势种的12个序列最为相似的序列来源于以下几个属：Flexithrix、粘纤维菌属(Cytophaga)、Dyella、聚球菌属(Synechococcus)、Chlorarachnion、支原菌属(Mycoplasma)、草螺菌属(Herbaspirillum)、河氏菌属(Hahella)、Ruegeria。优势细菌主要来自于Cytophaga—Flexibacter—Bacteroides门(CFB)和变形细菌门(Proteobacteia)。对于海水养殖系统来说，一些序列所代表的主要微生物极有可能是很少被注意到或研究过的，并且具有潜在的研究价值。
⑷扩增了8种病原性弧菌参考株、环境模型样品(8种病原性弧菌参考株的混合)以及4个环境弧菌分离株的rpoB基因片段，用于DGGE检测。作为对照，又对这8种病原性弧菌参考株的16S rRNA基因进行扩增并DGGE。结果表明：基于rpoB基因的PCR—DGGE能够很好地区分8种弧菌参考株，但是不能区分种内的不同株。而基于16S rRNA基因的PCR—DGGE不能完全区分这8种弧菌参考株，而且作为弧菌参考株有4个在DGGE中显示出异质性的条带。这些结果说明基于16S rRNA基因的PCR—DGGE在区分弧菌物种及用于弧菌分子生态分析时的局限性。而基于rpoB基因的PCR—DGGE能够避免这种局限，它提供了一种快速有效的用于病原弧菌分子生态分析及同时检测多个病原弧菌的方法。