论文部分内容阅读
目的:干眼为一种泪液和眼表的多因素疾病,其导致一系列症状包括眼不适,视觉障碍和泪液膜不稳定性增加及潜在的眼表面损伤等,并伴随着泪膜渗透压的增加和眼表面炎症的发生。严重的干眼可使患者生活质量明显下降,严重损害患者的视力,影响正常生活。研究发现,尽管引起干眼的起始病因不同,但炎症反应成为干眼病程发展中共同的关键因素。研究人员对干眼中的炎症反应进行了多项研究,发现促炎因子和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)在干眼患者病程发展中发挥重要的作用。干眼患者的泪腺功能单位(LFU)相关组织中出现大量淋巴细胞浸润,炎性介质和炎性细胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α、IL-23、IFN-γ、IL17、MMPs)显著增多,导致泪腺的分泌功能逐步下降,泪膜稳定性下降,诱发干眼临床症状。作为一种粘膜自身免疫性疾病,干眼的抗炎治疗成为目前研究的热点。目前干眼的抗炎治疗药物主要集中在皮质激素、环孢霉素A、四环素衍生物和必需脂肪酸类。在有效控制和缓解DED的体征和症状的同时也不可避免的带来一系列的不良反应,并且在给药形式和剂量方面需要进一步的探索。瑞巴派特(Rebamipide,Reb),化学名为2-[4-氯苯甲酰胺基]-3-[2(1H)-喹啉酮-4-yl]丙酸,分子式C19H15ClN2O4,分子量370.7864,最早作为胃肠道保护药物,用于治疗胃溃疡和胃炎,通过增加胃粘膜血流量、前列腺素E2合成和胃粘液分泌、清除氧自由基等环节,促进消化溃疡的愈合及炎症的改善。最近研究表明,Reb可以用于干眼的治疗,Reb滴眼液于2012年被日本正式用于治疗干眼疾病。Reb滴注能够有效减轻干眼患者的病症,改善屏障功能并减少炎性细胞因子的释放,显示出其作为一种促粘蛋白生成和分泌药物还具有抗炎作用。但是目前关于瑞巴派特治疗干眼的抗炎机制研究相对较少,因此,探究瑞巴派特治疗干眼的抗炎机制将为未来的深入研究提供理论基础,为干眼的抗炎治疗提供新的思路,有望在未来减轻干眼的用药负担。在干眼的病程进展中,T淋巴细胞特别是T辅助17亚型(Th17)发挥着至关重要的作用。研究发现多种慢性炎性疾病可由Th17细胞引起,目前认为,将Th17细胞作为靶点在治疗自身免疫病和癌症方面具有极大的应用潜力。Treg T细胞是一类具有负性调节功能的T细胞亚群,能抑制CD4~+T细胞从而抑制干眼的眼表炎症损害。多种疾病的治疗均与调节机体的Th17/Treg细胞平衡相关。有研究发现瑞巴派特在关节炎中能够调节Th17/Treg细胞的分化平衡。TOLL样受体(Toll-like receptors,TLRs)在免疫应答中发挥重要的作用,可以抑制TregT细胞的作用。其中,TLR4是第一个被鉴定的TOLL样受体,被证实其表达与自身免疫疾病相关,在调控免疫应答方面具有重要的功能,TLR4/MyD88/NF-κB通路与多种疾病具有高度相关性,TLR4在干眼的表达显著升高。MyD88是TLR4的一种胞质适配器,活化的TLR4与MyD88相互作用,激活下游的NF-κB通路,启动下游基因的转录,使IL-6、TNF-α、IFN-β等细胞因子表达。研究发现,一些药物对慢性炎性疾病的治疗与该药物抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路的活化相关。基于以上的研究结果,本研究将从Th17/Treg细胞平衡以及TLR4/MyD88/NF-κB通路的角度探讨瑞巴派特对干眼的抗炎治疗作用,本研究利用皮下注射氢溴酸茛菪碱联合模拟干燥环境建立小鼠干眼模型,观察干眼的病理变化及瑞巴派特对干眼组织损伤的保护作用。在此基础上检测瑞巴派特对干眼小鼠相关炎症因子的表达影响并初步探讨瑞巴派特对Th17/Treg细胞分化平衡的影响,探讨瑞巴派特在干眼小鼠中调控TLR4/MyD88/NF-κB通路的治疗机制。研究方法:将96只8周龄C57BL/6小鼠随机分为四组,正常对照组,干眼(DE)组,DE+平衡盐溶液(DE+BSS)组和DE+2%Reb组各24只。正常对照组皮下注射生理盐水2周,后三组皮下注射氢溴酸茛菪碱2周构建干眼小鼠模型,DE+BSS组眼部滴注BSS给药2周,DE+2%Reb组眼部滴注2%瑞巴派特滴眼液给药2周。酚红棉线法检测各组小鼠建模后及治疗后泪液分泌量,检测泪膜破裂时间(BUT)、角膜荧光素染色及K10免疫荧光染色明确各组小鼠眼表损伤情况。HE染色观察各组小鼠角膜组织、泪腺组织和结膜组织的病理学变化。通过Real-time PCR检测各组小鼠结膜和泪腺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17、IL-23、TGF-β、IL-10在mRNA上的表达水平。ELISA检测结膜和泪腺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17、IL-23、TGF-β、IL-10蛋白的表达水平。Real-time PCR检测小鼠泪腺组织中MMP-9的表达水平,探讨瑞巴派特对小鼠眼表和泪腺炎症的影响。通过Real-time PCR检测颈部和下颌淋巴结中ROR-rt和Foxp3的表达水平,流式细胞术检测淋巴结中CD4~+IL-17~+Th17细胞和CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞的比例,免疫荧光双染检测角膜与泪腺组织中CD4~+IL-17和CD4~+Foxp3~+双阳性细胞的比例,探讨瑞巴派特对Th17/Treg细胞平衡的影响。通过Real-time PCR检测小鼠颈部和下颌淋巴结中TLR4、MyD88、IL-1β和IL-23的mRNA表达。Western blot检测淋巴结中TLR4、MyD88、IκB、p-IκB以及细胞核中NF-κB蛋白的表达,探讨瑞巴派特对TLR4/MyD88/NF-κB通路活化的影响。结果:1、干眼小鼠的泪液分泌量显著低于正常小鼠,经过瑞巴派特治疗之后,治疗组小鼠的泪液分泌量轻微高于模型组小鼠。干眼小鼠与正常小鼠相比,眼表损伤情况严重,而瑞巴派特治疗之后,小鼠的眼表损伤情况得到明显改善,泪膜破裂时间延长。干眼小鼠角膜K10表达水平高于正常小鼠,而瑞巴派特治疗之后,小鼠角膜中K10的表达水平趋向于正常小鼠。HE染色结果显示干眼小鼠与正常小鼠相比,角膜发生明显损伤,细胞排列紊乱,在经过瑞巴派特治疗后,小鼠角膜组织的细胞排列较为规则,角膜缺损改善。泪腺组织的染色结果显示干眼小鼠的腺泡结构异常,出现空泡样变,细胞排列紊乱,而瑞巴派特的治疗明显改善了泪腺组织的细胞形态。结膜组织染色结果显示干眼小鼠结膜中杯状细胞数目减少,而瑞巴派特的治疗明显增加杯状细胞的数目。2、小鼠结膜组织中Real-time PCR和ELISA的检测结果显示,在mRNA和蛋白水平上,干眼小鼠结膜中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17、IL-23的表达量均上调,TGF-β、IL-10的表达量下调,瑞巴派特可以上调干眼小鼠结膜中TGF-β、IL-10的表达,下调IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17、IL-23的表达。泪腺中检测结果与结膜组织中一致,在干眼小鼠的泪腺组织中,IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17、IL-23在mRNA和蛋白水平上的表达量均高于正常小鼠,而TGF-β、IL-10的表达量低于正常小鼠。经过瑞巴派特治疗之后,IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17、IL-23的表达量下调,TGF-β、IL-10的表达量上调。同时,干眼小鼠泪腺中MMP-9的表达量升高,瑞巴派特治疗后,MMP-9的表达量相比于干眼组中有所下降。干眼小鼠颈部和下颌淋巴结中,ROR-rt的表达量大幅度提高,Foxp3表达量显著下降,瑞巴派特可以提高干眼小鼠淋巴结中Foxp3的表达,下调ROR-rt的表达。流式细胞术检测结果显示,干眼小鼠的颈部和下颌淋巴结中Th17细胞比例显著高于正常小鼠,Treg细胞比例无明显变化。免疫荧光双染结果显示,干眼小鼠角膜与泪腺中CD4~+IL-17~+双阳性细胞数目增多,且CD4~+Foxp3~+双阳性细胞数目减少,而瑞巴派特治疗后,CD4~+IL-17~+双阳性细胞数目减少,且CD4~+Foxp3~+双阳性细胞数目增加。瑞巴派特治疗能够提高干眼小鼠Treg细胞的比例,降低Th17细胞比例。结论:1、瑞巴派特能够轻度增加干眼小鼠的泪液分泌,稳定泪膜,缓解干眼小鼠的眼表和泪腺损伤。2、瑞巴派特可以通过影响干眼小鼠结膜和泪腺中炎症相关细胞因子的表达,改善干眼小鼠的眼表和泪腺炎症。瑞巴派特可以调节干眼小鼠Th17/Treg细胞平衡,提高Treg细胞分化,减少Th17细胞分化。3、瑞巴派特可以通过抑制TLR4和MyD88的表达和NF-κB的活化,影响下游炎症因子的转录,减轻干眼小鼠中的炎症反应。