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目的脑卒中的高死亡率和高致残率,给社会及个人带来沉重的经济负担。目前临床治疗脑卒中主要为组织型纤溶酶原激活物血管内溶栓,但对于超过治疗时间窗的患者,由于治疗手段有限仍存在着较高的致残率。近年来,在脑缺血模型实验及脑卒中临床试验中,研究者发现干细胞具有促进神经功能恢复作用。干细胞是一种具有自我更新和多向分化能力的细胞,主要包括胚胎干细胞和成体干细胞二大类。胚胎干细胞因受伦理及成瘤性等问题的限制难于转化应用,而成体干细胞由于可取自自体,显示出更强的转化应用前景,其中以间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）最受关注。目前研究较多的MSCs主要取自骨髓、脂肪等组织,存在来源有限、取材有创等问题。近年来,本课题组建立了从人体尿液中分离并大量扩增培养干细胞（urine-derived stem cells,USCs）的技术体系,证实USCs符合MSCs特征,具有成骨、成脂、成软骨及成神经等多向分化潜能;同时还发现USCs具有促进血管新生修复皮肤创面及骨损伤的功能。由于USCs可来自自体,且来源无限、取材无创,在转化应用方面显示出明显的优势。但直接移植干细胞仍然面临着血管栓塞、长期体外培养导致的基因变异等风险。近年的研究发现干细胞主要通过旁分泌机制发挥功能,且其中最受关注的是干细胞分泌的外泌体（Exosomes）。Exosomes是由细胞分泌的纳米级的生物囊泡,粒径范围在30-100nm之间,其主要通过包裹并转运来源细胞的miRNA、mRNA和蛋白质等生物活性物质至效应细胞而发挥生物学功能。已有研究表明MSCs来源的Exosomes,在心肌缺血、皮肤损伤及脑卒中等疾病模型研究中,发挥着与MSCs相似的修复作用。然而USCs来源的Exosomes（USCs-Exo）是否具有修复神经功能损伤目前尚未见报道。鉴于USCs在取材及来源方面所具备的独特优势,本实验拟以脑卒中大鼠为实验模型,通过神经功能评分、血管新生及神经再生充分评估USCs-Exo对脑卒中后神经功能的修复作用,以期为临床治疗缺血性脑卒中提供新方法。方法1.USCs的培养、鉴定及USCs-Exo的收集与鉴定根据本课题组建立的方法从健康成人的尿液中提取USCs,流式细胞术鉴定其表面标记;超速离心与超滤相结合的方法提取USCs-Exo,q-NANO检测Exosomes的大小,透射电镜观察USCs-Exo形态特征,蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测USCs-Exo特异性的蛋白标志物Alix、tsg101和CD63。2.脑卒中模型构建及实验分组采用经典的线栓法建立大脑中动脉栓塞大鼠（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型。实验分USCs-Exo治疗组、MCAO组（Control组）和假手术组,每组10只;术后24h,USCs-Exo治疗组尾静脉注射3×1011个的USCs-Exo,MCAO组和假手术组分别注射等量PBS。3.USCs-Exo对脑卒中后神经功能的影响根据mNSS神经功能评分表和粘附物移除测试（adhesive removal test）,评估各组大鼠手术前以及手术第1、3、7、14天后神经功能表现。4.USCs-Exo对脑卒中后血管新生和神经再生的影响取术后第7天和第14天的各组脑组织,通过Ki67免疫荧光染色观察脑内细胞增殖状况;通过CD31和CD34免疫荧光染色观察血管新生状况;通过DCX、Nestin和Sox2免疫荧光染色观察神经再生情况。5.USCs-Exo对脑卒中后神经细胞凋亡的影响取手术后第7天和第14天的各组脑组织,通过TUNEL染色法观察神经细胞凋亡情况。结果1.成功从尿液中提取USCs并大量扩增培养P0代USCs呈成纤维细胞样的克隆;P3代USCs呈均一的成纤维细胞形态;流式细胞术结果显示USCs表面分子CD29、CD73和CD44的呈阳性表达,HLA-DR、CD45和CD34呈阴性表达,符合MSCs的特征。2.成功从USCs培养基中富集USCs-Exo超速离心与超滤相结合的方法可从培养基中富集到USCs-Exo,q-NANO检测结果显示,USCs-Exo粒径分布范围在30-100nm,每15毫升培养基可富集到1010数量级的USCs-Exo;透射电镜观察下USCs-Exo表现为囊泡样结构;Western blotting结果显示USCs-Exo表达Exosomes的特征性蛋白Alix、Tsg101和CD63。3.USCs-Exo可显著促进脑卒中后的神经功能恢复神经功能评分结果显示,术后第14天,USCs-Exo组大鼠神经功能评测结果明显优于MCAO组（Control组）大鼠（P<0.05）。4.USCs-Exo显著促进卒中后脑组织中的血管新生和神经再生免疫荧光染色结果显示:术后第7天和第14天,USCs-Exo组Ki67、CD31、CD34、Dcx、Nestin和Sox2阳性细胞数增加,显著高于对照组（P<0.05）。5.USCs-Exo可显著减少卒中后脑组织中神经细胞的凋亡同MCAO组（Control组）相比,术后第7天和第14天,USCs-Exo组TUNEL染色阳性细胞明显减少（P<0.05）。结论1.静脉输注USCs-Exo可显著促进大鼠脑卒中后的神经功能恢复,为应用干细胞治疗脑卒中提供了新的技术策略;2.USCs-Exo主要通过促进缺血区脑组织的血管新生、抑制缺血区脑组织的细胞凋亡和促进神经细胞再生,从而达到修复脑卒中后大鼠的神经功能。