论文部分内容阅读
胰岛素用于临床已有80多年的历史,由于它是治疗糖尿病的特效药物和糖尿病患者在人口中的比例相当高,所以对胰岛素的需求量一直很大,这就促使人们不断寻求和探索更加有效的表达系统和表达策略。本实验室利用基因工程的方法将改造后的人胰岛素原基因加载到质粒pET28（+）a上,然后将其转化入大肠杆菌Rosettatm（DE3）,经过菌种选育,获得了重组人胰岛素的高水平表达,并通过对实验室摇瓶培养条件的研究,得到了优化后的发酵条件:基因工程大肠杆菌生长2h菌体密度就能达到OD600值0.8,在此时加入诱导剂效果最好,诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol/L;诱导4h;诱导温度为37℃;Kana浓度对菌体蛋白的表达影响不大,加入30mg/L用以抑制杂菌的生长。重组人胰岛素原在大肠杆菌中表达时易形成不溶性、无活性的包涵体,因此,必须经过体外变性、复性的过程。为了减少包涵体中的杂质对复性产生的影响,需要在复性前对菌体及包涵体进行洗涤,实验对含有不同尿素浓度的洗涤液进行试验比较,最后选定用含2 mol/L尿素的包涵体洗涤缓冲液对包涵体进行洗涤3次。通过对变性液中DTT浓度、复性液中氧化还原对条件、pH值、小分子添加剂以及复性方式等多种因素进行的研究,得出了包涵体目的蛋白变性液的优化复性条件:DTT浓度为60mmol/L,GSSG浓度为0.2mmol/L,GSSG:GSH为1:10,pH值为9.5,添加甘氨酸浓度为60 mmol/L,优化后的重组人胰岛素的复性率提高到65%。本实验还研究了目的蛋白分离纯化方法和酶切条件,寻找到合适的分离手段和酶切条件:复性液过DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析柱,pH值6.5,流速0.8ml/min,0.05mol/L可以将杂蛋白洗脱下来,0.1mol/L时洗脱目的蛋白,能够得到较纯的重组人胰岛素原。纯化后的重组人胰岛素原经TPCK—胰蛋白酶和羧肽酶B的协同酶切、Sephadex G-25柱纯化后,得到了重组人胰岛素。SDS-PAGE电泳分析条带与重组人胰岛素标准品条带位置一致。经HPLC分析,保留时间也同重组人胰岛素标准品基本一致。实验结果表明重组人胰岛素融合蛋白在大肠杆菌中获得了正确表达,优化后的分离工艺使得蛋白纯度和收率都大大提高,为重组人胰岛素的进一步研究奠定了良好基础。