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研究背景正常角膜是无血管的、透明的结缔组织,它具有眼部的机械屏障和屈光间质的作用。同时角膜也是一个免疫豁免的组织,这也是角膜移植成功率较高的原因。血管生成是指新的血管从预先存在的血管结构中生长出来的过程,许多病理条件都可能导致角膜新生血管的产生,并导致严重的后果。引起角膜新生血管的原因有：感染性和免疫性疾病、眼外伤、佩戴角膜接触镜等。角膜新生血管可影响视力,也是角膜移植术后发生移植排斥反应的高危因素,并导致炎症、角膜瘢痕和水肿产生。角膜新生血管的形成是一个复杂的病理过程,确切发病机制目前仍不清楚,主要有以下几种学说(1)缺氧学说(2)炎症学说(3)消除角膜水肿的机械屏障破坏(4)细胞因子平衡学说。目前多数学者倾向于细胞因子平衡学说,认为新生血管刺激因子与抑制因子之间的平衡失调是新生血管形成的重要机制。基于细胞因子平衡学说,目前对于新生血管性疾病治疗的研究着眼于血管生成之间的平衡,一方面可以加强新生血管抑制因素,另一方面可削弱新生血管刺激因素。色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor, PEDF),是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的非抑制性成员,是由单基因编码、相对分子质量为50000的糖蛋白,存在于所有的脊椎动物中,在不同物种间高度保守。它是一种多功能蛋白,已证实的功能包括神经营养、亲神经元性、神经保护、胶质抑制、抗肿瘤、抗新生血管和抗血管渗漏。在抗新生血管方面,PEDF是已知最强的内源性血管抑制因子,是“加强新生血管抑制因素”最主要的方式,它在正常人眼组织中高表达,被认作是维持角膜、玻璃体无血管的关键因素。Avastin是VEGF-A的单克隆抗体,是“削弱新生血管刺激因素”最主要的药物,其用于抑制角膜新生血管已开展较多实验研究,也有临床报告,显示出较好的疗效。为了研究PEDF对角膜新生血管的作用,本实验首先建立碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管模型,然后运用PEDF制成滴眼液观察其对新生血管的抑制作用,并与Avastin组比较,同时设立地塞米松组作为对照标准。第一部分碱烧伤大鼠角膜新生血管模型的建立目的探索碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管(CNV)动物模型的建立,为下一步的实验提供稳定可靠的动物模型。方法随机将/24只)SD大鼠分成3组,每组8只,右眼作为实验眼,左眼作为正常对照眼。采用浸润lmol/L氢氧化钠的3mm滤纸片,分别制作烧灼时间为20s、30s、45s的碱烧伤鼠眼模型,每天裂隙灯观察角膜新生血管生长的情况,观察7d。结果烧伤后7d,20s、30s和45s组CNV诱导率分别为62.7%、100%、100%,20s诱导率组分别与30s、45s组具有显著性差异(P<0.05)。20s组CNV长至烧灼区,散在稀疏分布,呈单条状；30s组CNV深入烧灼区,CNV致密,连接成网状,生长均匀一致；45s组50%的实验眼出现较为严重的前房积血,影响到新生血管的观察。结论采用浸润lmol/L氢氧化钠溶液的3mm滤纸片烧灼中央角膜30s的大鼠模型是角膜新生血管较理想的动物模型。第二部分PEDF抑制碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管的研究目的观察局部应用PEDF对大鼠碱烧伤后角膜新生血管的抑制作用,并与Avastin比较；并初步探讨PEDF抑制角膜新生血管的机制。方法1.建立实验动物模型与分组：以右眼作为实验眼,左眼为正常对照眼,建立碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管模型,将40只SD大鼠随机分为A、B、C、D4组,每组10只。A组于烧伤当天开始点用10μg/ml PEDF滴眼液；B组于烧伤当天开始使用5mg/ml Avastin滴眼液；C组于烧伤当天开始使用0.1%地塞米松磷酸钠滴眼液；D组于烧伤当天开始点用生理盐水。均每日4次,每次10μL,共用12日。2.角膜新生血管的观察：从烧伤后第1天开始,每日用裂隙灯显微镜观察角膜新生血管生长情况,于第7天行角膜烧伤程度分级,于第3、7、12天测量CNV长度和计算CNV面积,并于第12天照相。3.组织病理学检查：烧伤后第12天,每组随机取5只大鼠,麻醉后采用颈椎脱臼法处死,迅速摘除眼球,沿角膜缘剪下角膜组织,置于4%多聚甲醛溶液中固定,石蜡包埋后做4μm连续切片,取其中一份,常规苏木精-伊红染色,中性树胶封片,光学显微镜下观察并拍照。4.免疫组织化学检测VEGF、CD31表达：各取一份切片分别行VEGF和CD31免疫组织化学染色。二甲苯脱蜡,3%过氧化氢室温湿盒孵育10min, PBS清洗。在包含0.05%胰蛋白酶的山羊血清中孵化30分钟。一抗4℃孵育过夜,二抗室温下孵育30min。DAB显色,苏木素复染、水洗、返蓝。乙醇梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光镜下观察并拍照。5.免疫印迹法检测大鼠角膜VEGF的表达：在上述时间点处死每组其余5只大鼠,取下角膜组织并立刻冻存在液化氮中,将角膜样本在裂解液中均质化,提取实验眼角膜总组织蛋白,每泳道上样等质量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,将蛋白转至硝酸纤维素膜,印迹膜在放入盛有5%脱脂奶粉溶液的平皿中,37℃摇床内孵育1h,封闭非特异性抗原,加入一抗,4℃过夜孵育,洗膜,加入二抗,室温孵育1h, PBST洗膜,ECL化学发光法检测,β-actin为内对照。图片采用image J软件分析。结果1.CNV的观察碱烧伤后24h,各组角膜缘血管网充盈,角膜中央浑浊水肿,未见新生血管长入；第3天,D组新生血管芽深入角膜缘,新生血管密集,在角膜上方呈刷状迅速生长；A、B、C组新生血管相对稀疏,长势较缓；第12天时A组新生血管未达烧灼区,血管细小,色淡,稀疏,B、C组新生血管较短,血管刚达烧灼区,末梢血管有交联,血管较细小；D组新生血管接近角膜中央,血管密集,粗大。2.不同时间点各组CNV面积(mm2)各时间点A、B、C组角膜新生血管面积均小于D组(P<0.01)。第三天时,A、B、C组之间两两相比,差异无统计学意义(P>0.05)；第七天与第十二天,A组角膜新生血管面积均小于B、C组(P<0.01),B组与C组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。3.组织病理学观察第12天,A组新生血管较少,管腔小且较为稀疏,炎症细胞浸润少,角膜组织结构趋于整齐；B、C组新生血管增多,未见大量炎性细胞浸润,角膜组织结构相对整齐,D组角膜基质层见大量新生血管,管腔大且密集,血管腔内可见较多成熟的红细胞,周围大量炎性细胞浸润,角膜组织结构紊乱。正常对照眼无新生血管,组织排列整齐。4. VEGF和CD31免疫组织化学分析正常对照眼无新生血管,VEGF仅在角膜上皮层和内皮层有微弱的表达；A组新生血管稀少,VEGF在角膜上皮、内皮层及基质层少量表达；B、C组新生血管密度增高,VEGF表达增多；D组新生血管密集而粗大,角膜上皮和基质层可见VEGF大量表达,主要分布于上皮全层和新生血管区域。CD31是血管内皮细胞的标志物,正常对照眼未见CD31阳性表达；A组表达较弱；B、C组表达增强；D组可见CD31大量表达,主要分布于新生血管区域。5.角膜组织VEGF免疫印迹结果结果显示A、B、C组的VEGF表达均较D组低(P<0.01),而A组表达较B、C组低(P<0.01),B组与C组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.大鼠角膜碱烧伤后局部应用PEDF有抑制角膜新生血管的作用。2. PEDF对角膜新生血管的抑制作用强于Avastin和地塞米松。3. PEDF可能通过下调VEGF和控制炎症反应抑制角膜新生血管。4. PEDF有一定的抗炎作用。