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第一部分小鼠体内B10细胞的检测及体外活化方案建立目的评估小鼠不同组织中B10细胞的比例及IL-10表达,探索及建立B10细胞体外活化方案。方法采用流式细胞仪检测小鼠不同组织来源B10细胞及IL-10+B细胞的表达；利用FACS (fluorescence-activated cell sorting,荧光激活细胞分类术)分选B淋巴细胞亚群,评估胞内因子IL-10的表达；体外LPS ( Lipopolysaccharide,月旨多糖)联合PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate,12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇)、Monensin (莫能菌素)和Ionomycin (离子霉素)活化B细胞,观察不同刺激时间对B10细胞激活的影响,建立其体外活化条件。结果①小鼠脾脏CD19+CD5+CD1dhiB细胞比例为3.95%±0.79%,CD19+IL-10+B细胞比例为2.02%+0.16%,与外周血、肠系膜淋巴结及外周淋巴结相比表达最高,组问有统计学差异(P<0.05)；②IL-I0主要由CD5+CD1dhiB细胞亚群分泌,CD5CD1dhi. CD5-CD1dlo及CD5+CD1dlo B细胞亚群表达L-10均较少.组间有统计学差异(P<0.01)；③LPS联合PMA、Monensin和Ionomycin刺激5h能活化B10细胞分泌IL-10。延长LPS的作用时间(48h)显著促进CD19+CD5+CD1dhiB细胞高表达(11.24%±1.26%,P<0.01)及IL-10分泌增加(6.71%±0.64%,P<0.01)。结论B10细胞在小鼠脾脏高表达,通过TLR (Toll-like receptor, Toll样受体)信号通路被激活,活化后的B10细胞进一步高表达免疫抑制因子IL-10。第二部分B10细胞的功能鉴定及免疫调节机制研究目的 分离小鼠B10细胞并鉴定其生物学功能,探讨其对效应性T细胞(CD4+CD25-T)及Tregs (Regulatory T cells,调节性T细胞)的免疫调节机制。方法MACS (Magnetic-activated cell sorting,磁活性标记细胞分选术)分选小鼠CD19＋B细胞,体外活化48h,进一步利用FACS分选CD19+CD5+CD1dhiB细胞；MACS分选CD4+CD25-T细胞和Tregs,利用MLR (Mixed lymphocyte reaction,混合淋巴细胞反应)观察B1 0细胞对CFSE (5,6-carboxyfluorescein diacetateN-succinimidyl ester,羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)标记的CD4+CD25-T细胞CD4+CD25+T细胞增殖的调节作用及作用机制。结果①MACS联合FACS成功分选CD19+CD5+CD1dhiB及CD19+CD5-CD1dloB细胞,分选纯度均在95%以上；②CD19+CD5+CDldhi B细胞在体外可抑制CD4+CD25-T细胞增殖(13.75%±0.96% vs.32.76%+0.81%,P<0.01),促进CD4＋T细胞分泌IL-10 (0.47%±0.25% vs.0.21%±0.05%, P<0.01);③ CD19+CD5+CD1dhiB细胞可促进Tregs增殖(26.60%+1.14% vs.21.52%±0.81%,P<0.01)。结论MACS联合FACS分选方法能够分选出高纯度的CD19+CD5+CD1dhiB细胞,这些细胞具有免疫抑制性,可抑制CD4+CD25 T细胞增殖,促进Tregs增殖,其可能免疫调节机制是IL-10的释放增加。第三部分B10细胞在胰岛移植免疫应答中的调节作用及机制研究目的 研究小鼠同种异体胰岛移植免疫进程中免疫细胞及细胞因子的变化,进一步探讨B10细胞对同种异体免疫排斥反应的调节作用及作用机制。方法 以STZ(Streptozotocin,链脲佐菌素)诱导的糖尿病BALB/c小鼠作为受体,C57BI/6小鼠作为供体,静脉转输FACS分选的CD19+CD5+CD1dhiB细胞,并联合小鼠肾包膜下胰岛移植。观察移植物的存活时间；HE染色评估移植物的病理学特征；采用流式细胞术检测移植前后小鼠脾脏、肾引流淋巴结和外周血中B10细胞、IL-10、CD4+/CD8+、Tregs及IFN-γ+/IL-17+亚群的变化；ELISA法检测移植前后血清IFN-γ,及IL-10水平。结果①供体分离纯化的胰岛呈圆形或椭圆形,大小不一,包膜完整,AO/PI染色示胰岛活率>95%;②1×106个CD19+CD5+CD1dhiB细胞联合胰岛移植组移植物的平均生存期为(9.00±0.82)天,较单纯胰岛移植组生存时间(7.43+0.79天)延长,但差异无统计学意义(P=0.877),进一步输注2×106个CD19+CD5+CD1dhi B细胞,胰岛移植物的生存期为(9.57+0.79)天,与单纯胰岛移植组生存时间相比,差异仍无统计学意义(P=0.848)；③移植后第7天,CD19+CD5+CD1dhi B细胞联合胰岛移植受体,组织病理学显示胰岛形态完整；④ CD19+CD5+CD1dhiB细胞可使胰岛移植受体脾脏、肾引流淋巴结及外周血中B10细胞、IL-10、Tregs表达增多,而cD4+/CD8+及IFN-γ+/IL-17＋比值降低：⑤CD19+CD5+CD1dhiB细胞上调胰岛移植后血清IL-10水平,同时下调IFN-γ水平。结论1×106个CD19+CD5+CD1dhi B细胞可明显增加胰岛移植后负向免疫调节细胞及抑制性细胞因子的产生,减少正向免疫调节细胞及促炎症因子的表达,但对移植物的存活时间无显著延长作用。