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目的:病毒在细胞与细胞间的传播是人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）在人体内播散的重要途径。树突状细胞（dendritic cell,DC）是人体内功能最强的抗原提呈细胞,在诱导T细胞增殖活化,启动初次免疫应答中发挥重要作用,但同样也会在HIV向靶细胞传播的过程中起到桥梁的作用。传统的DC主要分为髓系来源的DC（Myeloid DC,MDC）及类浆细胞样DC（Plasmacytoid DC,PDC）。但后来Knut Sch?kel等又发现一群新的DC亚群,其细胞表面特异性表达6-磺基N-乙酰乳糖胺（6-sulfo LacNAc）,因而被称为slanDC,可以用单克隆抗体M-DC8来识别。不同于传统DC,slanDC表达CD16,细胞学特征更类似单核细胞,具有髓系来源细胞的特征,并且在外周血中的数量比MDC和PDC多,约占外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的0.6%-2%。体外研究结果显示,单核细胞诱导的树突细胞（monocyte-derived dendritic cell,MDDC）在HIV的反式传播中起到重要作用。提示slanDC在HIV向靶细胞的传播中可能发挥重要作用。HIV病毒在细胞间的传播有种主要机制。第一种,即顺式传播,HIV-1感染靶细胞,其RNA经反转录形成DNA整合到靶细胞DNA上,跟随宿主细胞复制产生子代病毒释放到细胞外临近另外一个靶细胞的地方,从而感染新的靶细胞。第二种反式传播,病毒在细胞中并不完成逆转录、整合、复制等,而是仅仅将细胞作为桥梁,通过一些表面分子捕获HIV病毒并保留在细胞表面,在靠近另一个靶细胞时形成病毒学突触,通过这种密切接触传播病毒。slanDC上表达DC-SIGN,这是一种在HIV向靶细胞传播中起重要作用的分子。而证据表明单核、巨噬细胞、单核细胞诱导的树突细胞（monocyte derived dendritic cells,MDDC）均能通过siglec1向靶细胞传递HIV。本研究拟通过对HIV感染者的研究,明确HIV感染者以及HAART治疗有效者slanDC表面是否表达siglec1及水平;通过的slanDC染毒后与靶细胞共培养的体外实验,明确slanDC是否能在HIV的细胞间传播中起作用,探讨这种作用是否与siglec1相关,为揭示slanDC在HIV感染过程中细胞间的传播途径提供依据。研究方法:1、研究对象。14例HIV感染未治疗者,28例高效抗逆转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy,HAART）有效者,均来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊。健康对照组（NC）19例,为随机抽取的HIV抗体阴性、未暴露于HIV的健康人。2、CD4+T细胞绝对值的检测。将20μl BD公司CD4FITC/CD8 PE/CD3 PerCP试剂加入绝对计数管中,逆向加样法加入50μl混匀的抗凝全血,室温避光15min,加入1×免洗溶血素450μl,室温避光15min,应用FACS Calibur流式细胞仪进行检测,MultiSET软件分析结果,得到CD4+T淋巴细胞的绝对值。3、HIV-1病毒载量测定。以1200μl血浆采用标准版模板制备法提取RNA,采用Roche公司The COBAS?AmpliPrep?/COBAS?TaqMan?HIV-1 Test试剂盒在Roche COBAS?AmpliPrep?上提取核酸后手工转移到COBAS?TaqMan?系统进行全自动PCR反应体系制备及病毒载量检测。4、HIV分离株扩增。取10ng病毒株感染5×106经PHA刺激后的健康人PBMC2.5h,加D10培养液调整浓度至1×106/ml,置于37℃,95%湿度,5%CO2培养箱。每2天收集培养上清并补充培养基,每周补充PHA刺激后健康人PBMC。ELISA法定量测定p24抗原含量。P24抗原大于10ng即扩增阳性,收集病毒液培养阳性上清,-156℃深低温冰箱保存备用。5、luciferase检测。取出培养箱中的96孔板,吸弃上清,每孔加入100ulPBS。每孔加入50ul荧光素酶检测试剂,避光反应2分钟。反复吹打3-5次,吸取100ul混合液于96孔白板中,迅速将96孔白板放入酶标仪内进行检测。6、slanDC和单核细胞亚群表面siglec1的检测。标记好流式管,依次向流式管中加入提取的的PBMC,每管加入相应的荧光抗体组合,slanDC:HLA-DR-APC-cy7、M-DC8-FITC;其他:CD14-Percp-cy5.5、CD16-PE-Cy7、siglec1-PE。混匀后,4摄氏度染色30min,用含2%FBS的PBS洗两次,上样前加入200μl含1%多聚甲醛的固定液。7、slanDC分选。取50ml健康人EDTA抗凝全血,提取外周血PBMC于三支50ml离心管中,洗涤两遍,转移到三支无菌的流式管中,每管加入20ulBIolegend公司的HLA-DR-APC-cy7和20ul miltenyi公司的M-DC8-FITC,4℃避光反应30分钟,洗两遍,每管补充2mlR10培养液,使用BD公司的流式细胞分选仪分选slanDC。8、slanDC向靶细胞传递HIV-1NL4-3。slanDC分选后铺于96孔板（U底）,调整每孔细胞数为2*105,每孔加入IFN-α（终浓度为1000U/ml）置于37℃,95%湿度,5%CO2培养24小时。取出96孔板,每孔加入100ul HIV-1NL4-3,补充R10培养液至200ul,置于37℃,95%湿度,5%CO2培养4小时。取出96孔板,将细胞转移至流式管,洗涤,弃上清。重悬,再一次洗涤,取100ul上清于48孔培养板空白孔,弃掉其余上清,用100ulR10培养液重悬细胞并转移至48孔培养板另一空白孔,每孔中均加入TZM-BL细胞2*105,补充R10培养液至400ul,置于37℃,95%湿度,5%CO2培养4小时。9、统计学分析。应用SPSS20.0软件包进行统计分析,数据处理成中位数,两组间实验指标的比较采用Mann–Whitney U检验,统计概率采用双侧检验,P<0.05为有统计学意义。结果:1、HIV感染者slanDC表面siglec1的表达情况。未治疗组slanDC细胞上的siglec1的表达高于HARRT治疗组和健康对照组（P<0.001,P<0.001）,HARRT治疗组与健康对照组之间无统计学差异（P=0.474）。CD14++CD16+、CD14+CD16+、CD14+CD16-是单核细胞的三个亚群,同样的趋势也发现于单核细胞的亚群中。即未治疗组CD14++CD16+细胞上的siglec1的表达高于HARRT治疗组和健康对照组（P<0.001,P<0.001）,HARRT治疗组与健康对照组之间无统计学差异（P=0.126）;未治疗组CD14+CD16+细胞上的siglec1的表达高于HARRT治疗组和健康对照组（P<0.001,P<0.001）,HARRT治疗组与健康对照组之间无统计学差异（P=0.987）;未治疗组CD14+CD16-细胞上的siglec1的表达高于HARRT治疗组和健康对照组（P<0.001,P<0.001）,HARRT治疗组与健康对照组之间无统计学差异（P=0.373）。2、HIV感染者slanDC表面siglec1的表达与CD4+T数量的关系。HIV感染者的（HARRT治疗与未治疗）slanDC表达siglec1的百分比与CD4+T细胞的数量无显著相关性（P=0.727）。同样CD14+CD16+、CD14+CD16-、CD14++CD16+细胞表面siglec1表达量与CD4+T数量也无显著相关（P=0.449,P=0.996,P=0.876）。3、HIV感染者slanDC表面siglec1的表达与病毒载量的关系。Siglec1+slanDC的百分比与血浆中的病毒载量有显著相关性（P=0.0059,r=0.655）。与单核细胞的各亚群相比,CD14+CD16+、CD14+CD16-、CD14++CD16+细胞群表面siglec1表达量均与血浆病毒载量具有显著相关性（P=0.0255,P=0.0011,P=0.0015）。4、slanDC感染HIV后向靶细胞传播病毒的情况。利用流式细胞分选仪分选slanDC后,药物处理细胞,24小时后,加HIVNL4-3病毒37摄氏度孵育4小时后充分洗涤,与TZM-Bl细胞共培养48小时,检测luciferase。可以看到slanDC具有向靶细胞传播HIV的作用。Washing blank孔作为参照,病毒并没有完全洗净,但slanDC,尤其IFNa诱导siglec1表达增加后,能向靶细胞传播病毒。使用siglec1a抗体封闭后可发现HIV向靶细胞的传播被抑制55.78%-79.68%。结论:1.slanDC表面表达siglec1。HIV感染后slanDC的siglec1表达增加,治疗后siglec1表达下降,提示HAART有助于降低HIV感染者感染后slanDC表面升高的siglec1。2.slanDC能向靶细胞传播HIV,这种传播作用能被siglec1单克隆抗体抑制。提示slanDC可能在HIV传播中发挥重要作用,这种作用可能与siglec1有关。