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翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCIP)广泛存在于动物、植物及酵母中,植物TCIP是一类在进化上高度保守的蛋白,植物间保持很高的同源性,而与动物的同源性较低。但又因TCTP在结构上的相似性,所以植物TCTP具有类似动物TCTP的各种功能,主要有促进细胞增殖和植物生长、抗高低温、盐碱、重金属等逆境的作用。随着TCTP在越来越多的植物中发现与克隆,可以预见TCTP可能存在更广泛的功能和重要性,但是目前对植物TCTP的研究主要还停留在基本结构与表达特性的研究上,所以探索该基因更多潜在的功能对获得具有自主知识产权的新基因以及对该基因的应用具有极其重要的指导意义。
本研究根据结球甘蓝翻译控制肿瘤蛋白基因(BoTCTP)cDNA序列设计特异引物扩增出303bp的干扰片段,按照相反方向分别连接到pFGC5941载体上,成功构建了RNAi表达载体。并通过农杆菌介导的遗传转化方法将该表达盒导入芥蓝,通过基因沉默来鉴定该基因的功能。其不定芽经过两代筛选,最后获得25株抗性植株和若干抗性芽。检测的34个抗性芽中有23个扩增出550bp左右Bar基因的特异带;25株抗性植株中有12株扩增出目的带,PCR阳性率为59.3%,转化率大约为1.5%。根据PCR检测结果,选择了3株能稳定扩增单一特异目的条带的阳性植株进行PCR—Southern杂交,结果表明阳性质粒及阳性植株均有目的条带,而对照植株未出现目的条带,说明RNAi表达盒已经成功导入芥蓝。
对PCR检测为阳性的植株进行了与生长相关的实验以及高、低温逆境胁迫实验,分别对阳性植株和对照植株的各个生长阶段的生长状况进行了对比,结果表明阳性植株相对于对照生长缓慢,表现为阳性植株生长减慢、叶片面积增长变缓、株高明显低于对照、生根困难且根系较弱等等。在40℃的高温逆境胁迫条件下,阳性植株同样表现为耐热性降低,高温培养24h即开始出现失绿、萎蔫,Sd后全部死亡,而对照植株则表现较高的耐热性,持续高温3d后才开始出现少许的失绿症状,5d后仍然有50%保持鲜绿;将其置于4℃条件下培养,它们并未立即表现明显的失绿症状,仅表现为生长速度的减缓。而阳性植株相对于对照植株的相对生长率较低,从而表明基因BaTCTP与芥蓝的生长密切相关,且对芥蓝的抗逆性起一定的调控作用。