论文部分内容阅读
急性单核白血病(AML-M5)是急性髓细胞白血病(AML)的一种，由于增殖失控、凋亡受阻、及分化障碍，克隆性白血病细胞在骨髓及其它造血组织中大量增殖、积累，并浸润其它组织器官，同时使正常造血功能受到抑制。目前，虽然化疗与造血干细胞移植这两种干预策略在AML-M5患者身上获得了良好疗效，但却只限于年轻患者，应用范围受到年龄、身体机能状态等多种因素的影响。因此，创建并研发应用范围更广的、有效的、新型AML-M5疗法一直是医学、免疫学、生物学等相关研究领域内的热点课题。 间充质干细胞(MSC)疗法已在肿瘤治疗方面显示出明显的应用前景，MSC具有独特的“tumor-homing”的特性及低免疫原性，可以迁移到肿瘤部位，能通过分泌多种功能性分子、与肿瘤细胞发生直接相互作用等方式而发挥抗肿瘤功能。特别重要的是:MSC移植不易诱发免疫排斥反应，基本保证了治疗的安全性。但至今为止，MSC在AML-M5治疗方面的研究还鲜有报道，特别是MSC与AML-M5细胞间的相互作用机制尚不清楚。由于AML-M5是一类白细胞增殖失控、凋亡受阻、分化障碍的血液学疾病。因此，本研究从探索MSC调控急性单核白血病细胞的存活和分化两方面入手，阐释MSC对AML-M5进展的抑制作用。具体研究内容及结论主要包括以下两部分: 一、MSC抑制急性单核白血病细胞存活的功能 1.细胞实验: 为了从多维度观察MSC抑制急性单核白血病细胞存活的生物学效应，并进一步为体内实验提供充分的基础信息，我们首先设计了基于体外共培养模型的细胞实验，来检测MSC对白血病细胞的凋亡和增殖的影响，其中直接接触共培养模拟MSC与白血病细胞近距离通讯，而间接接触共培养模拟MSC通过分泌功能性分子调控白血病细胞的生命活动;通过对这两种作用方式结果的分析，我们发现:共培养能导致急性单核白血病细胞的命运发生转化，MSC近距离调控，可诱导白血病细胞发生凋亡，凋亡发生率约为20％;间接接触虽然抑制白血病细胞增殖，但不诱发白血病细胞凋亡;有趣的是，两种接触方式均可导致白血病细胞的周期阻滞在G0/G1期，阻滞率为15％-20％;细胞实验结果说明:MSC可通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞以抑制急性单核白血病细胞存活。 2.MSC诱导白血病细胞凋亡及细胞周期阻滞的分子基础: 1) MSC诱导细胞凋亡的机制:在MSC近距离调控白血病细胞的细胞实验中，我们观察到白血病细胞向MSC周围聚集这一生物学现象，提示:MSC可通过招募白血病细胞来实现近距离调控;首先，我们对MSC招募急性单核白血病细胞的效应进行了分析，通过对MCP-1、CCL-5、CXCL12、CCR2、CCR3、CCR5、及CXCR4等介导MSC招募免疫细胞的主要趋化因子和相应受体进行检测，我们发现:MSC主要通过分泌MCP-1和CCL-5来实行对白血病细胞的招募，导致白血病细胞向MSC周围聚集，使两种细胞得以近距离接触;两种细胞的相互作用导致细胞间的相互活化，分析表明:两种细胞相互作用后，白血病细胞表达IFN-γ、IL-1β等功能性分子的水平明显升高，伴随IFN-γ、IL-1β的升高，MSC中凋亡诱导配体TRAIL的表达水平也显著升高，这就给我们一个启示:二者互相活化可导致MSC通过表达TRAIL诱导白血病细胞凋亡;因此，在通过细胞生物学分析，验证直接相互作用可诱导白血病细胞凋亡的基础上，我们进一步探讨了MSC通过TRAIL诱导凋亡的机制，通过分析凋亡相关的功能性分子，我们发现，伴随MSC中TRAIL的表达水平升高，白血病细胞中TRAIL的受体APO2的表达水平也平行升高，并诱导白血病细胞发生线粒体依赖的凋亡;为了对这一机制进行确认，我们对凋亡上游的关键节点TRAIL进行了阻断分析，运用anti-TRAIL的抗体阻断MSC表面的TRAIL、用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除MSC中的TRAIL，能显著逆转MSC诱导的白血病细胞凋亡;对凋亡机制的分析结果说明:MSC与白血病细胞的近距离通讯能导致MSC中TRAIL的表达水平明显升高,通过TRAIL与其受体APO2的相互识别，使凋亡通过线粒体依赖的通路发生，因此，MSC可显著诱导白血病细胞凋亡。 2)MSC诱导细胞周期阻滞的机制:在细胞实验中，MSC显现了诱导白血病细胞细胞周期阻滞的显著效应，说明MSC在诱导白血病细胞凋亡的同时，还可以阻滞细胞周期;据报道，MSC可通过分泌TGF-b、HGF、IL-10、IDO等多种功能性分子来诱导免疫细胞的细胞周期阻滞，而IFN-γ在该生物学过程中发挥了关键的调控作用;此外，我们在MSC诱导细胞凋亡的机制研究中发现:MSC诱导白血病细胞表达IFN-γ的水平显著升高，因此，在MSC诱导白血病细胞周期阻滞的机制研究方面，我们以INF-γ为出发点，聚焦于探讨IFN-γ如何介导了MSC的功能改变？通过对MSC中TGF-b、HGF、IL-10、IDO等功能性分子的检测，我们发现:IFN-γ可显著上调MSC中IDO的表达水平，达到300倍;IDO已被多次报道可通过发挥其酶活性，而诱导细胞周期阻滞，前期工作发现给我们一个研究线索，在此，我们对MSC是否通过分泌IDO介导白血病细胞周期阻滞进行了探讨，研究发现，与白血病细胞相互作用后，MSC中IDO的表达水平和酶活性均显著升高;根据这一现象，我们运用IDO的抑制剂对IDO的功能进行了验证，发现:IDO的抑制剂NLG919能显著逆转MSC诱导的白血病细胞周期阻滞;对细胞周期阻滞的分析结果说明:MSC与白血病细胞的相互活化可导致MSC分泌IDO的水平显著升高，MSC分泌的IDO通过作用于白血病细胞，诱导白血病细胞的细胞周期阻滞，这是我们的又一个新发现。 3.MSC抑制急性单核白血病进展的疗效评估: 1)急性单核白血病动物模型构建:采用尾静脉接种白血病细胞的方式来构建急性单核白血病动物模型;通过对小鼠发病率、平均存活时间、脏器受累（肝脏、脾脏、肾、心脏和肺）等指标的观察，界定发病时间及病理进展状态，基于分析，选取尾静脉接种U937细胞（107/只）的方式构建白血病动物模型，接种后，小鼠发病率100％，平均存活时间约为19天，肝脏、脾脏、和肺出现明显肿大现象，成功模拟了临床AML-M5型白血病的典型病理特征。 2)疗效评估:根据从细胞实验中获取的功能分子（IFN-γ和IL-1β）活化MSC的效应，选取IFN-γ (50ng/ml)和IL-1β (20 ng/ml)预活化的MSC (Pre-act MSC)，将其用于小鼠急性单核白血病的治疗;疗效评估结果显示:与Saline 治疗组相比，Pre-act MSC治疗后，白血病小鼠平均存活时间延长了11天、小鼠外周血中白血病细胞的比例减少了约32％、骨髓中白血病细胞的比例减少了约11％、脏器（肝脏、脾脏和肺）中白血病细胞的浸润率显著降低;而MSC治疗后，白血病小鼠平均存活时间延长了3天、小鼠外周血中白血病细胞的比例减少了约20％、骨髓中白血病细胞的比例减少了约9％、脏器（肝脏、脾脏和肺）中白血病细胞的浸润率显著降低;根据动物整体水平的治疗效果评估，发现MSC与Pre-act MSC治疗均能抑制白血病小鼠的病理进展，与MSC治疗相比，Pre-act MSC的疗效显著提高。 3) AML-M5患者血样分析:依据动物实验中选取的MSC预处理方案，我们对MSC、Pre-act MSC诱导13例AML-M5患者来源的白血病细胞凋亡的状态进行了评估;结果显示:MSC能诱导其中5例患者来源的白血病细胞发生凋亡，凋亡诱导率约40％; Pre-act MSC能诱导其中6例患者来源的白血病细胞发生凋亡，凋亡诱导率约46％;值得注意的是:针对同一例患者来源的白血病样本，Pre-act MSC诱导白血病细胞凋亡率显著高于MSC;由此可见，MSC与Pre-act MSC均能诱导AML-M5患者来源的白血病细胞凋亡，但与MSC相比，Pre-act MSC的诱导凋亡率更高。 该部分研究从细胞、动物整体、人样本三个层面探讨了MSC抑制急性单核白血病进展的效应。通过细胞实验，成功构建了MSC与白血病细胞的共培养模型，并运用该模型发现了MSC诱导白血病细胞凋亡并阻滞细胞周期的效应;白血病细胞通过分泌功能分子IFN-γ、IL-1β刺激MSC活化，活化的MSC通过TRAIL与其受体APO2的相互识别，诱导白血病细胞凋亡;而白血病细胞周期阻滞则是由于MSC分泌的IDO调控的。基于细胞实验信息，成功构建急性单核白血病动物模型，并采用MSC、Pre-act MSC进行治疗，结合人标本的运用，得到重要结论:MSC与Pre-act MSC均可抑制急性单核白血病进展，但与MSC相比，Pre-act MSC抑制效果更强。该部分研究的创新之处:首次提出MSC与Pre-act MSC抑制急性单核白血病进展的效应，并提出新机制。 二、SW-22协同MSC诱导急性单核白血病细胞分化的效应与机制 在该部分研究中，我们聚焦于探讨化学小分子SW-22协同MSC诱导急性单核白血病细胞分化的效应与机制。首先，研究了MSC诱导急性单核白血病细胞分化的功能，在此基础之上，进一步探讨了SW-22对MSC功能转化的调控作用，以期阐明MSC诱导白血病细胞分化的新机制及小分子调控MSC抑制白血病进展的分子机理，为进一步建立有效的、新型AML-M5治疗策略提供理论依据。 1.细胞实验: 在基于体外共培养模型的细胞实验中，通过对白血病细胞形态、细胞表型(CD14、CD11b、CD68及CD117)、及细胞吞噬功能的分析，我们发现:MSC可诱导白血病细胞向更成熟的单核-巨噬细胞分化;与未处理的白血病细胞相比，MSC刺激后，CD 14+CD 11b+的白血病细胞比例增加了约30％;白血病细胞中CD11b、CD14和CD68的基因表达水平显著升高，髓系前体细胞标志物CD117的基因表达水平明显降低;白血病细胞的吞噬能力显著增强;并且以上生物学效应不依赖于MSC的近距离调控;以上细胞实验结果说明:MSC可通过分泌功能性分子作用于白血病细胞的方式，诱导急性单核白血病细胞向更成熟的单核-巨噬细胞分化; 2.MSC诱导急性单核白血病细胞分化的分子基础: 在明确MSC通过分泌功能性分子诱导白血病细胞分化的基础上，我们首先对MSC分泌的功能性分子的类型进行了分析，通过分子截留实验，发现:MSC分泌的能诱导白血病细胞分化的功能分子主要是蛋白质，这就给我们一个启示:MSC的分泌组极有可能介导了MSC对白血病细胞分化的诱导作用;因此，在MSC诱导白血病细胞分化的机制研究方面，我们以探索MSC的分泌组为出发点，聚焦于探讨何种功能分子介导了MSC对白血病细胞分化的诱导作用，通过对MSC分泌的VEGF、IGF-1、TSG-6、TNF-α、LIF、IL-6及IL-7等功能性分子的检测，我们发现:静息状态下的MSC能分泌大量的IL-6，白血病细胞刺激后，MSC中IL-6的基因表达水平以及IL-6的分泌量均进一步显著升高;IL-6已被多次报道能诱导急性单核白血病细胞向更成熟的单核-巨噬细胞分化，前期工作发现给我们提供一个研究线索，在此，我们优先对IL-6是否在MSC诱导白血病细胞分化的过程中发挥调控作用进行了探讨，研究发现:外源加入IL-6能明显诱导白血病细胞分化，然而与MSC相比，IL-6诱导白血病细胞分化的能力相对较弱;而用anti-IL-6的中和抗体阻断MSC分泌的IL-6后，能显著逆转MSC诱导白血病细胞分化的效应;对分化机制的分析结果说明:IL-6作为MSC分泌的诱导白血病细胞分化的重要功能性分子之一，在MSC诱导急性单核白血病细胞分化的过程中发挥了重要的调控作用。 3.SW-22协同MSC诱导白血病细胞分化的机制: 以探索通过诱导白血病细胞分化而抑制AML-M5进展的新疗法为目的，我们进一步探讨了1，25(OH)2D3的新型结构类似物SW-22、gzhx-33和gzhx-56分别单独或者与MSC联合使用，对急性单核白血病细胞分化的诱导作用;通过对白血病细胞的细胞表型、功能分子表达、及细胞吞噬功能的分析，我们发现:小分子化合物SW-22不仅能单独通过激活白血病细胞中的VDR诱导白血病细胞分化，还能协同MSC诱导白血病细胞分化;SW-22是VDR的激动剂，这就给我们一个启示:SW-22可能通过靶向激活MSC中的VDR，增强MSC诱导白血病细胞分化的能力，进而协同MSC诱导白血病细胞分化;为了对这一机制进行确认，我们对MSC中的关键节点VDR进行了阻断分析，结果显示:干扰MSC中VDR的表达，能显著逆转SW-22协同MSC诱导白血病细胞分化的效应;此外，前期实验已证实，IL-6是MSC分泌的能诱导急性单核白血病细胞分化的重要功能性分子，这就给我们一个研究线索，在此，我们对IL-6与VDR的关系，以及IL-6是否介导了SW-22与MSC的协同作用进行了探讨，研究发现:SW-22能显著上调白血病细胞刺激后的MSC中IL-6的基因表达水平和IL-6的分泌量;并且，伴随MSC中的VDR的表达水平的降低，IL-6的表达水平也显著降低，以上结果说明:SW-22通过激活MSC中的VDR可导致MSC分泌IL-6的水平显著升高;根据这一现象，我们进一步运用IL-6中和抗体对IL-6的功能进行了验证，结果显示:用anti-IL-6的抗体阻断MSC分泌的IL-6后，能显著逆转SW-22协同MSC诱导白血病细胞分化的效应;以上对SW-22协同MSC诱导分化机制的分析结果说明:SW-22通过激活MSC中的VDR可导致MSC分泌IL-6的水平显著升高，MSC分泌的IL-6作用于白血病细胞，诱导白血病细胞分化，因此，SW-22可发挥协同MSC诱导白血病细胞分化的功能。 4.SW-22协同MSC抑制急性单核白血病进展的疗效评估: 1)动物整体水平疗效评估: 根据从细胞实验中获取的化学小分子SW-22能协同MSC诱导白血病细胞分化的效应，选取SW-22 (10ng/ml)与MSC单独或者联合使用来治疗小鼠急性单核白血病;疗效评估结果显示:与vehicle 治疗组相比，SW-22治疗后，白血病小鼠平均存活时间延长了4天、小鼠外周血中白血病细胞的比例减少了约19％、骨髓中白血病细胞的比例减少了约5％、肝脏和脾脏中白血病细胞的浸润率显著降低;MSC治疗后，白血病小鼠平均存活时间延长了5天、小鼠外周血中白血病细胞的比例减少了约15％、骨髓中白血病细胞的比例减少了约6％、脾脏中白血病细胞的浸润率显著降低;而SW-22与MSC联合治疗后，白血病小鼠平均存活时间延长了10天、小鼠外周血中白血病细胞的比例减少了约22％、骨髓中白血病细胞的比例减少了约9％、肝脏和脾脏中白血病细胞的浸润率显著降低;根据动物整体水平的治疗效果评估，发现SW-22与MSC单独或者联合治疗均能抑制白血病小鼠的病理进展，但与单独治疗相比，联合治疗的疗效显著提高。 4) AML-M5患者血样分析:我们对SW-22和MSC单独或者联合使用诱导10例AML-M5患者来源的白血病细胞分化的状态进行了评估;结果显示:SW-22能显著诱导其中4例患者来源的白血病细胞发生分化，分化诱导率为约40％; MSC能诱导其中3例患者来源的白血病细胞发生分化，分化诱导率约30％;而SW-22与MSC联合使用能诱导其中7例患者来源的白血病细胞发生分化，分化诱导率约70％;值得注意的是:在其中5例患者中，针对同一例患者来源的白血病样本，SW-22与MSC联合使用诱导白血病细胞的分化率显著高于二者单独使用;由此可见，SW-22与MSC单独或者联合使用均能诱导AML-M5患者来源的白血病细胞分化，但与单独使用相比，二者联合使用诱导分化率更高。 综上所述，该部分研究首次从MSC调控急性单核白血病细胞分化的角度出发，探讨了MSC抑制急性单核白血病进展的效应，并阐述了化学小分子SW-22调控MSC诱导白血病细胞分化的分子机理。在细胞实验中，首先，发现MSC可通过分泌IL-6诱导白血病细胞分化;在此基础上，进一步发现小分子化合物SW-22通过激活MSC中的VDR使其高表达IL-6，增强MSC诱导急性单核白血病细胞分化的能力，进而协同MSC诱导白血病细胞分化。基于细胞实验信息，采用SW-22与MSC单独或者联合使用进行小鼠急性单核白血病治疗，结合人标本的运用，得到重要结论:SW-22与MSC单独或联合使用均可抑制急性单核白血病进展，但与单独治疗相比，二者联合治疗抑制效果更强。该部分研究的创新之处:首次提出MSC和化学小分子SW-22调控的MSC通过诱导白血病细胞分化抑制急性单核白血病进展的效应，并提出新机制。