广东省慢生型花生根瘤菌的系统发育及共生匹配性研究

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花生是重要的油料作物,在食品及饲料领域有广泛应用。广东省是花生的种植大省和科技大省,但与花生共生的根瘤菌资源以及花生根瘤菌与广东省主要种植的花生品种的共生匹配性却缺乏深入研究。鉴于此,本文主要对广东省慢生型花生根瘤菌进行遗传多样性及系统发育研究,同时探讨慢生型花生根瘤菌中的代表菌株与不同花生品种的匹配性。  利用土壤捕捉实验,从来自广东省10个花生种植区土壤的花生根瘤中分离纯化了216株慢生型花生根瘤菌。对216株菌进行BOX-PCR指纹图谱分析,共产生71种遗传型。对此71株代表菌株进行ITS基因和持家基因recA、atpD的系统发育分析,获得19个遗传群,其中4个遗传群分别属于Bradyrhizobiumdiazoefficiens,B.yuanmingense,B.guangxiense和B.liaoningense。其余15个遗传群均为未定种慢生根瘤菌,表明广东省慢生型花生根瘤菌具有丰富的遗传多样性。结瘤基因nodA系统发育分析结果显示,代表的慢生根瘤菌分成了11个分支,与ITS及持家基因反映的系统发育关系存在明显差异,表明慢生型花生根瘤菌中共生基因nodA水平转移的频率很高。利用简并引物扩增并测序鉴定的方法,初步鉴定了71株代表菌株中,23株具有Ⅲ型分泌系统(T3SS),其保守基因rhcRST的系统发育关系与nodA较为一致。  在采样的10个种植区土壤中慢生型花生根瘤菌的α多样性差异明显,即地区间的花生根瘤菌多样性差异较大,其中阳江(YJ)和湛江(ZJ)土壤中花生根瘤菌的α多样性最高;同时β多样性计算结果显示,多个地区中慢生型花生根瘤菌有相似的种群分布。但珠海(ZH)和韶关(SG)的土壤中花生根瘤菌的分布也存在着种群的隔离。以ITS分群结果为基础,对采集地的土壤理化因子与花生根瘤菌的种群分布进行相关性分析,发现土壤pH值与速效钾是影响花生根瘤菌种群分布的主要因素。  根据ITS及nodA基因系统发育分析结果,分别选出代表菌株与广东省主要的花生品种进行共生匹配实验。结果表明,供试的菌株与品种的匹配组合间存在差异。但总体而言,不同花生品种与菌株间的选择性不强。综合评价各测定指标,菌株HY4与供试的花生品种匹配关系良好,将其作为广谱亲和菌株进行深入研究。  为了探究T3SS在慢生型花生根瘤菌与花生品种共生匹配过程中所起的作用,根据同源双交换的原理构建了代表菌株HY4的T3SS调控基因ttsI及结构基因rhcJ的突变载体。利用三亲本杂交将突变载体转入HY4中,并以抗生素抗性筛选标记及sacB反筛选标记进行HY4 T3SS突变体的筛选,但目前未获得双交换突变体。
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