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黄花苜蓿(Medicago falcalta L.)是一种耐寒性很强的豆科牧草，同时还具有耐旱和耐贫瘠等特性，是苜蓿抗性育种的重要基因库。从抗逆性强的植物中分离相关抗逆性基因是作物抗逆性基因工程中的重要手段。根据本实验室庞朝枢构建的“黄花苜蓿冷诱导基因抑制性缩减杂交文库”里筛选出来的早期光诱导蛋白(Early Light—Inducible Protein，ELIP)基因的主体片段，克隆出该基因编码区全长。通过半定量RT-PCR分析该基因在温度胁迫、盐胁迫、脱水胁迫和ABA处理条件下的表达规律，同时还探讨了该基因在紫花苜蓿中的同源基因在低温下的表达规律。本研究中还构建了pBI—MfELIP超表达载体，通过农杆菌介导转化烟草，筛选出数十株阳性转基因植株。并对转MfELIP基因T1代烟草进行低温、干旱、高盐、强光等逆境条件下的抗性分析，为进一步对MfELIP基因进行功能研究奠定了基础。主要研究结果如下：
1.黄花苜蓿MfELIP基因的克隆
利用NCBI数据库中同源基因序列设计PCR引物，从冷处理黄花苜蓿叶片cDNA中，通过RT-PCR扩增得到的黄花苜蓿MfELIP基因。MfELIP全长712 bp，GenBank登记号：EF422369，开放阅读框600 bp，编码199个氨基酸的蛋白。利用生物信息学的方法，对该基因的结构与功能进行了大量的生物信息学预测。
2.黄花苜蓿MfELIP基因的表达分析
半定量RT-PCR的结果表明，MfELIP在低温胁迫下其表达量会迅速上调，表明该基因与黄花苜蓿的抗冷性密切相关。而该基因对高温、盐和脱水胁迫的反应并不不强烈，只有低水平的诱导上调，高温处理2天其表达受到抑制；外源ABA对MfELIP的表达没有影响，表明MfELIP的表达不受ABA信号转导系统控制。在紫花苜蓿中，ELIP的同源基因也会受冷诱导表达，但表达的上调强度不及黄花苜蓿大，表达持续的时间不及黄花苜蓿长，黄花苜蓿高水平表达的持续时间在3天以上，而紫花苜蓿在第3天开始有下降趋势。
3.黄花苜蓿MfELIP基因转化烟草分析
构建了pBI—MfELIP超表达载体，通过农杆菌介导转化烟草，转基因植株经过PCR检测，筛选出58株PCR阳性植株，挑选14株转MfELIP烟草进行Southern杂交分析，结果表明这些转化植株来自不同的转化事件。这些转基因烟草的表型和生长情况与野生型烟草差异不大，说明超表达该基因对植株的正常生长影响不大。
4.转MfELIP烟草T1代植株的抗逆性分析
通过对野生型烟草与转MfELIP基因T1代烟草植株在正常条件和低温、干旱、盐处理、强光等逆境胁迫下生长状况的变化研究，表明在低温、干旱、盐处理等逆境胁迫下，野生型烟草受到逆境的影响，生长状况明显不如正常条件下，在强光处理下，野生型烟草的光系统和细胞膜收到严重伤害；而过量表达MfELIP的转基因T1代烟草则在上述逆境下表现出比野生型更强的抗性，受到逆境的影响明显比野生型植株小，说明MfELIP与植物的抗逆性关系密切。