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先天性畸形、创伤、肿瘤、感染、损伤后长期气管插管和某些自身免疫性疾病,可以导致气管狭窄或坏死,需要气管重建或移植。各种良性或恶性气管病变患者的主要治疗方法为气管切除术。然而,当病变的气管长度达到儿童的30%或成人的50%时,切除病变气管直接端端吻合将带来巨大风险。组织工程是结合工程技术和生物学原理应用于功能性组织替代的一个新兴研究,以促进受损组织再生,有望成为长段气管重建的有效治疗手段。本研究以新西兰兔为对象,通过脱细胞及京尼平交联方法得到气管支架,并种植自体骨髓间充质干细胞,运用生长因子,原位移植气管,综合评估原位移植效果,监测其免疫原性和排斥反应。在此基础上,通过梯度离心法获取自体骨髓单个核细胞,并使用细胞示踪剂绿色荧光蛋白标记自体骨髓单个核细胞。含有绿色荧光蛋白标记的自体骨髓单个核细胞可以在脱细胞气管支架上分化为软骨细胞,这一实验过程避免了干细胞在体外培养,大大缩短了组织工程气管的制备周期,节约了时间和经济成本,为需要组织工程气管移植的患者争取了更多的治疗时间。第一部分 京尼平交联脱细胞气管支架种植自体骨髓间充质干细胞的体内原位移植研究目的：通过对由京尼平交联的脱细胞气管支架进行原位移植,并在术中种植自体骨髓间充质干细胞进行研究,观察骨髓间充质干细胞在体内分化为软骨细胞的情况,并对上皮细胞再生情况及移植后炎症排斥反应进行评价。方法：1.脱细胞气管支架的制备；2.脱细胞气管支架的体外检测；3.自体骨髓间充质干细胞的培养与鉴定；4.气管原位移植；5.气管原位移植后检测。结果：1.气管脱细胞后,上皮细胞清除完全,软骨细胞大部分被清除,Ⅱ型胶原保留完整：2.通过全骨髓培养贴壁筛选法获取骨髓间充质干细胞,培养至第3代的骨髓间充质干细胞形态规则,具有多项分化潜能；3.脱细胞后京尼平交联的气管支架加骨髓间充质干细胞原位移植后,炎症反应程度与自体原位移植相似,种植的骨髓间充质干细胞在体内可以分化为软骨细胞。结论：1.通过去污剂-联合酶法获取了脱细胞气管支架,运用天然交联剂京尼平交联得到了京尼平交联脱细胞气管支架；2.采用全骨髓贴壁培养法分离纯化了自体骨髓间充质干细胞,利用骨髓间充质干细胞的形态特征及多向分化潜能鉴定了自体骨髓间充质干细胞；3.种植有自体骨髓间充质干细胞的脱细胞气管支架在原位移植实验中取得成功,自体骨髓间充质干细胞在体内分化为软骨细胞,未发生明显的排斥反应。第二部分 京尼平交联脱细胞气管支架种植自体骨髓单个核细胞的体内原位移植研究目的：通过对含有绿色荧光蛋白示踪剂的骨髓单个核细胞在京尼平交联的脱细胞气管支架原位移植中的研究,观察骨髓单个核细胞内绿色荧光蛋白含量,评估种植的自体骨髓单个核细胞分化为软骨细胞的情况,并对使用生长因子后外周血中单个核细胞含量进行评价,探讨自体骨髓单个核细胞在组织工程气管移植中的作用。方法：1.脱细胞气管支架的制备；2.293T细胞的复苏及培养；3.转染质粒的获取；4.293T细胞的转染；5.自体骨髓单个核细胞的获取；6.慢病毒的获取及细胞的感染；7.气管原位移植；8.气管移植后单个核细胞含量检测及单个核细胞分化为软骨细胞情况的检测。结果：1.293T转染含有绿色荧光蛋白质粒后细胞表达绿色荧光蛋白,并能合成含有绿色荧光蛋白可以感染其他细胞的慢病毒；2.含有绿色荧光蛋白的慢病毒可以感染骨髓单个核细胞,在荧光显微镜下可以看到细胞内有绿色荧光出现；4.种植有含绿色荧光蛋白的自体骨髓单个核细胞的京尼平交联脱细胞气管支架原位移植后,种植的骨髓单个核在体内可以分化为软骨细胞,在分化成的软骨细胞中含有绿色荧光蛋白。结论：1.绿色荧光蛋白可以在293T细胞内被包装在慢病毒内,在不影响其他细胞活性的情况下将绿色荧光蛋白转入其他细胞中；2.通过梯度离心得到的自体骨髓单个核细胞可以被含有绿色荧光蛋白的慢病毒感染,绿色荧光蛋白在不影响骨髓单个核细胞的情况下对其进行标记；3.通过慢病毒感染的方法对自体骨髓单个核细胞进行示踪,鉴定气管移植后再生的软骨细胞由种植的自体骨髓单个核细胞分化而来；4.自体骨髓单个核细胞在原位移植的京尼平交联脱细胞气管支架上可以分化为软骨细胞,这一过程避免了干细胞体外培养过程,节省了时间成本和经济成本。与骨髓间充质干细胞相比,骨髓单个核细胞是更为理想的一种干细胞。