硬叶兜兰菌根真菌的观察、分离和鉴定

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长期以来兰科植物一直受到人们的普遍关注,但人工栽培较为困难,主要原因在于,自然条件下,兰花种子的萌发和植物随后的生长发育往往需依赖与之共生的真菌,只有当这些真菌与兰花种子或根形成共生的菌根关系后,兰花才能正常地生长发育。因此,了解与兰根共生的真菌种类,进一步探讨兰花与真菌间的相互作用机制,将为兰科植物的栽培提供有价值的理论依据。 本文利用滑走切片机制作硬叶兜兰菌根的切片,经曲利苯蓝(trypanblue)染色,于光学显微镜下观察菌根的显微结构并照相。硬叶兜兰为单子叶植物,它的根结构具有根毛、根被、外皮层、皮层薄壁细胞、内皮层以及中柱结构。菌根表层、根被、皮层细胞都观察到菌丝,菌丝是直接穿过根被细胞再通过外皮层的通道细胞入侵到皮层细胞。菌丝进入皮层细胞后主要分布在靠外皮层的皮层细胞内,菌丝蜷曲形成菌丝结,然后被消化分解。根被细胞里还观察到菌丝的分生孢子和有性孢子,根毛细胞里也观察到有性孢子。 利用将经消毒的兜兰菌根根段于培养基中培养分离菌根真菌的方法,从菌根里分离到真菌15种。菌根真菌分离培养采用了PDA培养基,麦麸培养基,椰丝培养基,察氏培养基四种培养基。PDA培养基分离的真菌有4种,菌株代号为P1、P4、P7、P12。麦麸培养基培养分离的真菌有8种,菌株代号为M1、M2、M3、M6、M7、M8、M10、M12。椰丝培养基分离的真菌有3种,菌株代号为Y1、Y2、Y5,察氏培养基上未分离出。利用传统的形态特征鉴定方法和18SrDNA测序方法对所分离的真菌进行鉴定,M2为毛壳菌属的高大毛壳(Chaetomium elatum),M7为卷丝孢属(Helicomyces Link),M10为丝衣属(Byssochlamys zollerniae),M12为土曲霉变种(Aspergillus terreus),Y5为子囊菌(Ascomycotina),P7为丝核菌属(Rhizoctonia DC.)。M2、M10、Y5属于子囊菌,M7、M12、P7属于半知菌。 为确定所分离的真菌是否真正的共生菌,采用将分离的真菌与无菌苗共培养的方法,将分离所得的15种真菌分别与文心兰(Oncidium)及金钗石斛(Dendrobium nobile)的无菌苗在共培养基1和共培养基2里共培养。5个月后,接菌处理的生长状况普遍比对照差。文心兰和石斛在接种了P1、P4、P7、M6、M7、M8、P12 5个月后,全部枯萎,接种Y1、M1、M2、M3、M10、M12也大部分枯萎,接种了Y2、Y5的有部分枯萎。共培养基1里的文心兰接菌处理苗有8种完全死亡而金钗石斛接菌处理苗是7种,共培养基2的文心兰接菌处理苗有6种完全死亡。无论是文心兰还是金钗石斛,只有接种菌株M3和M12的根形成菌根结构。菌株M3和M12入侵到金钗石斛后都是在皮层薄壁细胞里形成菌丝团,我们可以看到菌丝团与菌丝团之间有菌丝连接,但是没有发现松散的菌丝,而在文心兰的压片里,我们看到的都是松散的菌丝,没有见到菌丝团。从形成菌丝团的情况分析,M3、M12很可能是共生菌,造成枯萎的原因可能是培养基成分的特殊性,导致真菌过渡生长,加之5个月的共培养时间太长,兰苗因营养缺乏而引起枯萎。
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