【摘 要】
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生物体内活性氮物种(RNS)介导的蛋白质硝化与人类衰老、癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等50多种疾病相关。3-硝基酪氨酸(3-NT)作为蛋白质硝化的产物之一,凭借着稳定的化学
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生物体内活性氮物种(RNS)介导的蛋白质硝化与人类衰老、癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等50多种疾病相关。3-硝基酪氨酸(3-NT)作为蛋白质硝化的产物之一,凭借着稳定的化学性质和在人体内形成后的不可逆性,作为指示RNS含量的重要生物标志物被用于众多生物学和病理学研究中。传统的3-NT和含3-NT蛋白的检测大多依赖仪器或3-NT抗体,具有极低的检测限和较高的灵敏度,但同时也有操作复杂,耗时长,样品前处理过程繁琐和处理后样品难以进行其他分析的问题。基于此,蛋白质的化学标记由于其兼容性好,化学选择性高,操作简单等优势逐渐被应用于含3-NT蛋白的标记、检测和富集。近年来针对3-NT的化学修饰大多都是以还原3-NT为3-氨基酪氨酸(3-AT)为起点,再基于特异性标记2-氨基-4-烷基苯酚结构的反应设计蛋白标记方法。受到高转化率、快速的偶氮染料制备反应的启发,本论文设计了一种将3-NT还原后偶氮化的标记策略,测试了其在小分子层面、多肽和蛋白样品中的特异性、检测限和兼容性,并在硝化损伤的细胞样品中进行了初步的应用。主要内容如下:第一章:简述了本论文的课题背景和立题意义,简单介绍了活性氧/活性氮物种在体内对生物大分子造成的影响及其检测。结合一些具体的例子,对酪氨酸的硝基化过程、3-NT的基本理化性质和蛋白酪氨酸被硝化后对蛋白结构和功能的影响进行了一个简单的介绍。最后列举了一些3-NT的检测实例,具体介绍了近几年发展的特异性化学标记含3-NT蛋白的方法。第二章:基于温和条件下高效的偶氮化偶联反应,本论文发展了一种选择性标记含3-NT蛋白的化学修饰策略,并在含3-NT的多肽和含3-NT蛋白上进行了测试,并最终有效的标记并检测了过氧亚硝基硝化的HepG2细胞中含3-NT蛋白。此法易操作,成本低,可在2 h内实现p-mol级别含3-NT蛋白的标记,对不同种类含3-NT蛋白具有较好的兼容性。连接部位可断裂的性质对标记后进行涉及抗体的分析也几乎没有影响。生物正交基团的引入也使得样品仅被衍生化一次即可用于多种分析。本章详述了本论文涉及到的实验方法、流程和结果讨论。第三章:总结了偶氮化标记含3-NT蛋白策略的优点和不足,展望了可能用于特异性标记含3-NT蛋白的方法。
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