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第一部分巨噬细胞源性TNF-α在肝前体细胞恶性转化中的作用及机制研究研究背景和目的原发性肝癌按照细胞来源通常分为三种类型：肝细胞癌(HCC)、肝内胆管癌(ICC)和混合型肝癌(CHC)。目前研究认为HCC与ICC分别来源于肝细胞和胆管细胞,CHC主要来源于肝前体细胞。然而,HCC的高度异质性及部分HCC表达干细胞标志物支持部分HCC来源于肝前体细胞的假说。研究人员对HCC的基因表达谱聚类分析发现,部分HCC具有肝母细胞或肝前体细胞样表达谱,提示肝前体细胞可能是HCC的来源之一。然而,目前对HCC的细胞来源尚存争议,缺乏充足的科学证据。因此,HCC的细胞来源仍有待阐明,从而优化HCC的病理分型,促进肝癌的治疗特别是个性化治疗。肝前体细胞,也叫卵圆细胞,具有分化为肝细胞和胆管细胞的双向分化潜能。当肝脏发生慢性损伤时,如病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝病等,肝前体细胞会代偿性活化。研究发现,从p53缺失小鼠分离的肝前体细胞能在裸鼠皮下形成肿瘤;过表达Ras能使小鼠原代肝前体细胞恶性转化为肝癌起始细胞,均证明肝前体细胞可以作为肝癌起始细胞的来源。本科室前期研究也发现,TGF-β长期刺激能使肝前体细胞发生恶性转化,成为肝癌起始细胞,从而促进肝硬化引起的肝癌发生。然而,肝前体细胞是否参与了慢性炎症引起的肝癌发生仍不清楚,有待阐明。慢性非可控性炎症是肝癌发生的显著特征及致病因素。越来越多的研究表明,炎症在肿瘤发生过程中有多种作用,但其分子机制尚不十分清楚。枯否细胞即肝脏组织中的巨噬细胞,是参与炎症反应最主要的炎性细胞,是重要的炎性因子TNF-α、IL-6的主要来源。Pikarsky等报道了在小鼠肝炎模型中TNF-a引起的NF-κB活化介导了肝细胞恶性转化。Karin等证明了IL-6/STAT3通路在肝癌发生中的重要作用。然而,巨噬细胞及其分泌的TNF-α、IL-6在肝前体细胞恶性转化中的作用尚不十分清楚。本课题的研究目的是探讨巨噬细胞及其分泌的炎性因子TNF-α、IL-6在肝前体细胞恶性转化中的作用及分子机制,不仅为肝癌发生提供新的思路,并且提出肝癌新的分子分型,为肝癌的个性化治疗提供重要参考。研究方法：1.对CK19阳性HCC病人组织进行肝前体细胞标志物OV6的免疫组织化学染色,统计CK19阳性病人中OV6阳性的比例。2.收集整理上述病人的临床病理信息和预后随访信息,统计分析OV6表达与CK19+肝癌病人的临床病理和预后的相关性。3.建立大鼠DEN诱癌模型,通过免疫组化染色研究在肝脏炎症过程中肝前体细胞的活化情况,通过RT-PCR分析肝脏中炎性因子表达与肝癌起始细胞(T-IC)标志物表达的相关性。4.采用免疫磁分选方法,从DEN大鼠第15周的肝脏中分选OV6阳性的肝前体细胞,进行NOD-SCID鼠皮下接种,观察肝前体细胞是否发生恶性转化。5.在大鼠DEN诱癌的基础上,建立GdCl3清除巨噬细胞模型,研究在肝癌发生中巨噬细胞对肝前体细胞的影响。6.采用免疫磁分选方法,从DEN/saline组和DEN/GdCl3组大鼠第15周的肝脏中分选肝前体细胞,研究清除巨噬细胞对肝前体细胞的影响。7.分离大鼠腹腔巨噬细胞,将LPS活化的巨噬细胞与大鼠肝前体细胞系进行Transwell共培养,研究巨噬细胞分泌的炎性因子对肝前体细胞自我更新的影响。8.用含巨噬细胞上清的条件培养基对肝前体细胞系进行长期刺激,通过体外克隆形成实验观察其对肝前体细胞恶性转化的影响。9.分别用细胞因子TNF-α、IL-6长期刺激肝前体细胞系,通过NOD-SCID鼠皮下荷瘤观察TNF-α、IL-6是否引起肝前体细胞恶性转化。10.通过检测TNF-α长期刺激的肝前体细胞的T-IC标志物表达、克隆形成、成球能力等,研究TNF-α长期刺激是否使肝前体细胞恶性转化为T-IC。11.利用慢病毒建立干扰TNFR1的肝前体细胞系,验证巨噬细胞分泌的TNF-α对肝前体细胞恶性转化的影响。12.通过核型分析,研究TNF-α长期刺激的肝前体细胞是否具有染色体不稳定性。13.通过细胞免疫荧光检测中心体的数目和结构、RT-PCR检测染色体不稳定性关键调控分子的表达,研究TNF-α引起肝前体细胞染色体不稳定性的机制。14.通过RT-PCR、western blot实验,检测TNF-α长期刺激的肝前体细胞中干性调控基因和信号通路关键分子的表达。15.通过染色质免疫共沉淀实验,证明p-STAT3对Nanog、Lin28启动子区的结合。16.用STAT3抑制剂验证STAT3对TNF-a长期刺激的肝前体细胞自我更新的影响。17.通过western blot实验检测调控STAT3的上游分子,并用Src抑制剂验证Src对STAT3的调控。研究结果：1.在CK19阳性的HCC中,OV6阳性比例为65%左右。2. CK19+OV6+肝癌比CK19+OV6-肝癌具有更侵袭性的病理特征,并且病人术后复发率更高。3.在大鼠DEN诱癌模型中,肝前体细胞随着时间明显扩增：肝脏中T-IC标志物的表达与炎性因子TNF-α的表达呈正相关。4.从DEN大鼠第15周肝脏中分选的OV6阳性肝前体细胞能在NOD-SCID鼠皮下形成肿瘤,且肿瘤组织表达AFP、CK19。5.与从DEN/saline组分选的肝前体细胞相比,DEN/GdCl3组分选的肝前体细胞的T-IC标志物表达降低；干性调控基因和自我更新能力降低。DEN/GdCl3组肝脏肿瘤数目少于DEN/saline组,且DEN/GdCl3组肿瘤中未检测到OV6表达。6.与巨噬细胞Transwell共培养促进了肝前体细胞的自我更新能力；含巨噬细胞上清的条件培养基长期刺激肝前体细胞系,使肝前体细胞获得了体外形成克隆的能力。7. TNF-a长期刺激使肝前体细胞发生恶性转化,并且形成的肿瘤表达AFP、CK19、 OV6、CD133。IL-6长期刺激未引起肝前体细胞的恶性转化。8. TNF-a长期刺激使肝前体细胞获得了T-ICs的特征,包括T-IC标志物表达升高、自我更新能力增强。9.干扰TNFR1抑制了巨噬细胞上清刺激引起的肝前体细胞的恶性表型。10. TNF-a长期刺激引起肝前体细胞的染色体不稳定性。11.UBD、Chk2异常表达参与了TNF-a引起的肝前体细胞染色体不稳定性。12. STAT3的活化介导了TNF-a长期刺激引起的肝前体细胞自我更新能力增强。13.Src参与了TNF-a长期刺激引起的STAT3的活化。结论：本研究将CK19和OV6联合应用作为肝癌的分子分型标志物,提示肝前体细胞来源的HCC,并指导肝癌病人预后。利用体内巨噬细胞清除模型和体外共培养模型证明了巨噬细胞在肝前体细胞恶性转化中发挥促进作用。巨噬细胞分泌的TNF-a引起UBD、Chk2异常表达使肝前体细胞发生染色体不稳定性,并活化Src/STAT3信号通路增强肝前体细胞自我更新能力,导致肝前体细胞向肝癌起始细胞恶性转化。研究结果为炎症促进肝癌发生提供了新的思路。第二部分Cyclin G1对肝癌起始细胞的调控及机制研究研究背景和目的原发性肝癌是一种恶性程度极高、预后极差的肿瘤,肝癌的5年内复发率高达70%。由于大部分肝癌病人诊断时已处于晚期,失去手术机会,故只能采用化疗或靶向治疗。但是,由于肝癌具有化疗抵抗的特征,常规化疗或动脉化疗栓塞均不能完全杀死肝癌细胞。因此,阐明肝癌复发与化疗抵抗的分子机制对提出新的治疗策略具有重要作用。近年来,越来越多的研究支持肿瘤干细胞理论,即肿瘤来源于一小群具有自我更新能力和多项分化潜能的肿瘤干细胞或肿瘤起始细胞。目前在多种肿瘤中均检测到肿瘤起始细胞的存在,如白血病、胶质瘤、乳腺癌、肝癌等。肝癌起始细胞可以被特定的细胞表面标志物所鉴定,如CD133、CD90、EpCAM、CD24、OV6等。肿瘤起始细胞具有起始肿瘤和化疗抵抗的特性。研究认为肝癌起始细胞可能是目前治疗效果差的最主要原因,清除肝癌起始细胞对肝癌长期消退甚至治愈十分关键。然而,目前肝癌起始细胞的调控机制尚不十分清楚,缺乏特异靶向肝癌起始细胞的治疗。因此,阐明肝癌起始细胞扩增的分子机制十分迫切。Cyclin G1(细胞周期蛋白G1)是细胞周期蛋白家族成员之一,与c-src具有同源性。研究报道cyclin G1受p53转录激活并对p53家族蛋白产生负反馈调节。在肝癌发生模型中,cyclin G1的缺失可导致肿瘤形成减少。本实验室前期研究表明cyclin G1能促进肝癌细胞发生EMT从而促进肝癌转移。然而,cyclin G1对肝癌起始细胞的调控及其在肝癌化疗抵抗、复发中的作用尚不清楚。本课题的研究目的是探讨cyclin G1对肝癌起始细胞的调控作用和分子机制,以及其在肝癌化疗抵抗和复发中的临床意义,为肝癌治疗提供新的策略。研究方法：1.通过RT-PCR检测化疗抵抗的移植瘤中cyclin G1的表达情况。2.采用Annexin V凋亡检测试剂盒,检测过表达cyclin G1的肝癌细胞和对照细胞对sorafenib引起凋亡的反应。3.将含138例肝癌病人的组织芯片进行cyclin G1的免疫组织化学染色,结合病人随访信息分析cyclin G1与病人术后复发的相关性；多因素分析评判cyclin G1作为术后复发的独立风险因素的可能性。4.分离病人原代肝癌细胞进行成球实验,比较贴壁原代肝癌细胞与sphere中cyclin G1的表达水平。5.在从sphere中分选的CD133+或OV6+的肝癌起始细胞与阴性细胞中检测cyclinG1的表达水平。6.通过RT-PCR检测30例肝癌病人原代sphere中cyclin G1、CD133、CD90的表达情况,并对cyclin G1和CD133或CD90的表达进行相关性分析。7.比较过表达cyclin G1的肝癌细胞和对照细胞中CD133、CD90的表达水平和形成sphere的能力。8.通过体外和体内有限稀释实验,比较过表达cyclin G1的肝癌细胞和对照细胞中肝癌起始细胞的比例。9.通过RT-PCR比较过表达cyclin G1的肝癌细胞和对照细胞中干性相关基因的表达水平。10.通过RT-PCR检测肝癌病人原代sphere中cyclin G1和Sox2的表达情况,并对cyclin G1和Sox2的表达进行相关性分析。11.利用siRNA干扰Sox2表达,分析其对cyclin G1促进肝癌起始细胞扩增的影响。12.将Akt、mTOR抑制剂联合应用,检测其对cyclin G1促进Sox2表达和成球能力的影响。13.将Akt、mTOR抑制剂联合应用,检测其对cyclin G1过表达抵抗sorafenib引起的凋亡的影响。14.将Akt、mTOR抑制剂联合应用,检测其对cyclin G1促进肿瘤起始的影响。研究结果：1.与对照相比,在化疗抵抗的移植瘤中cyclin G1的表达升高。2.过表达cyclin G1使肝癌细胞对sorafenib引起的凋亡不敏感。3. Cyclin G1高表达组病人术后复发率高于低表达组,且cyclin G1可以作为判断复发的独立风险因素。4.病人原代sphere中cyclin G1的表达水平高于贴壁细胞。5.在从sphere中分选的CD133+或OV6+的肝癌起始细胞中,cyclin G1的表达水平高于CD133-或OV6-细胞。6.与对照细胞相比,过表达cyclin G1的肝癌细胞中CD133、CD90的表达升高,且成球能力增强。7.与对照细胞相比,过表达cyclin G1的肝癌细胞中肝癌起始细胞的比例增多。8.过表达cyclin G1促进干性调控基因Sox2表达升高。9.敲低Sox2表达抑制了cyclin G1促进的肝癌起始细胞扩增。10. Akt/mTOR抑制剂抑制了cyclin G1对Sox2表达和成球能力的促进作用。11.Akt/mTOR抑制剂抑制了cyclin G1过表达对sorafenib引起的凋亡的抵抗作用。12.Akt/mTOR抑制剂抑制了cyclin G1促进肿瘤起始的作用。结论：本研究揭示了cyclin G1与肝癌复发、化疗抵抗的相关性。首次提出cyclin G1在促进肝癌起始细胞扩增中的作用,以及cyclin G1通过Akt/mTOR/Sox2信号通路调控肝癌起始细胞的扩增。本研究的结果为肝癌的个性化治疗提供了新的靶点。